स्यूडोमोनास सिरिंग पीवी के प्रतिरोध की उच्च-थ्रूपुट पहचान। टमाटर में टमाटर अंकुर बाढ़ परख का उपयोग
Summary
अंकुर बाढ़ परख स्यूडोमोनास सिरिंगजीवाणु के प्रतिरोध के लिए जंगली टमाटर परिग्रहण की तेजी से स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान करता है । यह परख, अंकुर जीवाणु विकास परख के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया, आगे जीवाणु के लिए अंतर्निहित प्रतिरोध की विशेषता में सहायता कर सकते हैं, और प्रतिरोध के आनुवंशिक आधार का निर्धारण करने के लिए मानचित्रण आबादी स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
टमाटर एक कृषि विज्ञानी महत्वपूर्ण फसल है जिसे ग्राम-नकारात्मक जीवाणु स्यूडोमोनास सिरिंगेसे संक्रमित किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप बैक्टीरियल स्पेक रोग होता है। टमाटर-पी सिरिंगपीवी। टमाटर रोगप्रणाली व्यापक रूप से पौधे जन्मजात प्रतिक्रियाओं और रोग प्रतिरोध के आनुवंशिक आधार को विच्छेदन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। जबकि रोग सफलतापूर्वक खेती टमाटर में Solanum पिंपिनालीफोलियम से Pto/Prf जीन क्लस्टर की शुरूआत के माध्यम से कई दशकों के लिए प्रबंधित किया गया था, पी सिरिंगे की दौड़ 1 उपभेदों Pto द्वारा प्रदत्त प्रतिरोध को दूर करने के लिए विकसित किया है/
जंगली टमाटर प्रजातियां रोगजनक मान्यता में प्राकृतिक विविधता के महत्वपूर्ण जलाशय हैं, क्योंकि वे विभिन्न रोगजनक दबावों के साथ विविध वातावरण में विकसित हुए। जंगली टमाटर में रोग प्रतिरोध के लिए विशिष्ट स्क्रीन में, वयस्क पौधों का उपयोग किया जाता है, जो पौधों की संख्या को सीमित कर सकते हैं जिन्हें उनके विस्तारित विकास समय और अधिक विकास स्थान आवश्यकताओं के कारण जांच की जा सकती है। हमने प्रतिरोध के लिए 10 दिन पुरानी टमाटर की पौध को स्क्रीन करने के लिए एक विधि विकसित की है, जो पौधों के विकास के समय और विकास कक्ष अंतरिक्ष को कम करती है, पौधों के तेजी से कारोबार की अनुमति देती है, और बड़े नमूना आकारों का परीक्षण करने की अनुमति देती है। जीवित रहने या मृत्यु के अंकुर परिणामों को असतत फेनोटाइप के रूप में या बाढ़ के बाद जीवित रोपण में नए विकास की मात्रा द्वारा परिभाषित प्रतिरोध पैमाने पर माना जा सकता है। इस विधि को दो पी सिरिंग उपभेदों के प्रतिरोध के लिए 10 दिन पुरानी टमाटर रोपण स्क्रीन करने के लिए अनुकूलित किया गया है और आसानी से अन्य पी सिरिंग उपभेदों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
स्यूडोमोनास सिरिंगे एक ग्राम-नकारात्मक रोगजनक जीवाणु है जो पौधे के मेजबानों की एक विस्तृत श्रृंखला को संक्रमित करता है। बैक्टीरिया स्टोमेटा या शारीरिक घावों के माध्यम से मेजबान पौधे में प्रवेश करते हैं और एपोप्ट1में पैदा होते हैं । पौधों ने बैक्टीरियल रोगजनकों द्वारा संक्रमण से बचाने के लिए दो-स्तरीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया विकसित की है। पहला स्तर पौधे की कोशिका की सतह पर होता है, जहां पौधे की कोशिका झिल्ली पर पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स पीएमपी-ट्रिगर प्रतिरक्षा (पीटीआई)2नामक प्रक्रिया में अत्यधिक संरक्षित रोगजनक-संबद्ध आणविक पैटर्न (पीम्प्स) का अनुभव करते हैं। इस प्रक्रिया के दौरान, मेजबान संयंत्र रक्षा प्रतिक्रिया रास्तों को अपनियंत्रित करता है, जिसमें सेल की दीवार पर कैलोज का जमाव, स्टोमेटा को बंद करना, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का उत्पादन और रोगजनन से संबंधित जीन शामिल करना शामिल है ।
बैक्टीरिया प्रोटीन देने के लिए एक प्रकार III स्राव प्रणाली का उपयोग करके पीटीआई को दूर कर सकते हैं, जिसे प्रभावक कहा जाता है, सीधे संयंत्र सेल3में । प्रभावक प्रोटीन आमतौर पर पीटीआई के घटकों को लक्षित करते हैं और रोगजनक उग्रता को बढ़ावा देते हैं4. प्रभावक प्रोटीन की मान्यता पर पौधे की प्रतिरक्षा का दूसरा स्तर पौधे की कोशिका के भीतर होता है। यह मान्यता प्रतिरोध जीन पर निर्भर करती है, जो न्यूक्लियोटाइड-बाध्यकारी साइट ल्यूसिन-रिच रिपीट को एन्कोड करती है जिसमें रिसेप्टर्स (एनएलआर) होते हैं। एनएलआर या तो प्रभावकों को सीधे पहचानने या उग्रता लक्ष्य या अपवित्र5पर उनकी गतिविधि को पहचानने में सक्षम हैं । फिर वे प्रभावक-ट्रिगर प्रतिरक्षा (ईटीआई) नामक प्रक्रिया में एक माध्यमिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर करते हैं, जो अक्सर एक अतिसंवेदनशील प्रतिक्रिया (एचआर) से जुड़ा होता है, जो संक्रमण6की साइट पर स्थानीयकृत कोशिका मृत्यु का एक रूप है। ईटीआई से जुड़े जीन-फॉर-जीन प्रतिरोध के विपरीत, पौधे मात्रात्मक आंशिक प्रतिरोध प्रदर्शित कर सकते हैं, जो कई जीन7के योगदान पर निर्भर है ।
पी सिरिंगे पीवी टमाटर (पीएसटी)टमाटर पर बैक्टीरियल स्पेक का कारण एजेंट है और यह लगातार कृषि समस्या है। क्षेत्र में प्रमुख उपभेदों आम तौर पर पीएसटी रेस 0 उपभेदों कि या तो या दोनों प्रकार III प्रभावकों AvrPto और AvrPtoB व्यक्त किया गया है । DC3000(पीएसटीDC3000) एक प्रतिनिधि दौड़ 0 तनाव और एक मॉडल रोगजनक है कि टमाटर में बैक्टीरियल धब्बा पैदा कर सकता है । बैक्टीरियल स्पेक रोग का मुकाबला करने के लिए, प्रजनकों ने पीटीओ [पी सिरिंगपीवी टमाटर]/Prf [Pto प्रतिरोध और फेनथिऑन संवेदनशीलता]जीन क्लस्टर को जंगली टमाटर प्रजाति सोलनम पिंपिनेलीफोलियम से आधुनिक खेती8,9में प्रवेश किया । Pto जीन एक सेरीन-थ्रेनोइन प्रोटीन किनेस को एन्कोड करता है जो पीआरएफ एनएलआर के साथ मिलकर, प्रभावकों AvrPto और AvrPtoB10,11,12,13,14की मान्यता के माध्यम से पीएसटीDC3000 के लिए प्रतिरोध प्रदान करता है। हालांकि, यह प्रतिरोध उभरते रेस 1 उपभेदों के खिलाफ अप्रभावी है, जो हाल के वर्षोंमें 15,16में उनके तेजी से और आक्रामक प्रसार की अनुमति देता है । रेस 1 उपभेदों को Pto/Prf क्लस्टर द्वारा मान्यता से बचने, क्योंकि AvrPto या तो खो दिया है या इन उपभेदों में उत्परिवर्तित है, और AvrPtoB कम सेकम 15,17,18जमा प्रतीत होता है ।
जंगली टमाटर की आबादी पीएसटी प्रतिरोध के लिए प्राकृतिक भिन्नता के महत्वपूर्ण जलाशय हैं और पहले इसका उपयोग संभावित प्रतिरोध लोकी19,20,21की पहचान करने के लिए किया गया है । हालांकि, रोगजनक प्रतिरोध के लिए वर्तमान स्क्रीन 4-5 सप्ताह पुराने वयस्क पौधों20,21का उपयोग करते हैं। इसलिए, वे विकास समय, विकास कक्ष अंतरिक्ष, और अपेक्षाकृत छोटे नमूना आकार से सीमित हैं। पारंपरिक दृष्टिकोणों की सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हमने 10 दिन पुराने टमाटर रोपण22का उपयोग करके एक उच्च-थ्रूपुट टमाटर पी सिरिंग प्रतिरोध परख विकसित की। यह दृष्टिकोण वयस्क पौधों का उपयोग करने पर कई फायदे प्रदान करता है: अर्थात्, कम विकास समय, कम स्थान आवश्यकताएं, और उच्च थ्रूपुट। इसके अलावा, हमने दिखा दिया है कि यह दृष्टिकोण ईमानदारी से वयस्क पौधों22में मनाए गए रोग प्रतिरोध फेनोटाइप को फिर से दोहराता है।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित अंकुर बाढ़ परख में, टमाटर रोपण बाँझ मुराशिगे और Skoog (एमएस) मीडिया के पेट्री व्यंजन पर 10 दिनों के लिए उगाया जाता है और फिर ब्याज के बैक्टीरिया और एक सर्फेक्टन सरफेस्ट युक्त एक inoculum के साथ बाढ़ आ जाती है । बाढ़ के बाद, रोपण मात्रात्मक बैक्टीरियल विकास परख के माध्यम से रोग प्रतिरोध के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, अंकुर अस्तित्व या मृत्यु बाढ़ के 7-14 दिनों के बाद एक असतत प्रतिरोध या रोग फेनोटाइप के रूप में कार्य कर सकती है। यह दृष्टिकोण पीएसटी रेस 1 उपभेदों, जैसे पीएसटी स्ट्रेन टी 1(पीएसटीटी 1) के प्रतिरोध के लिए बड़ी संख्या में जंगली टमाटर परिग्रहण की स्क्रीनिंग के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विकल्प प्रदान करता है, और आसानी से ब्याज के अन्य बैक्टीरियल उपभेदों के अनुकूल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
टमाटर के रोपण में इन जीवाणु उपभेदों के प्रतिरोध का पता लगाने के लिए अनुकूलित पीएसटीDC3000 या पीएसटीT1 के साथ बाढ़ टीका के लिए एक प्रोटोकॉल वर्णित है। रोपण प्रतिरोध परख में इष्टतम परिणामों के लिए कई म?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम रोग या प्रतिरोध परिणामों पर मीडिया की मात्रा के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए जेमी Calma शुक्रिया अदा करते हैं । हम पांडुलिपि पर रचनात्मक टिप्पणियां और सुझाव प्रदान करने के लिए लुईस लैब से डॉ Maël Baudin और डॉ कार्ल जे Scheiber शुक्रिया अदा करते हैं । लुईस प्रयोगशाला में पौधों की प्रतिरक्षा पर अनुसंधान USDA ARS 2030-21000-046-00D और 2030-21000-050-00D (JDL), और एनएसएफ जैविक विज्ञान IOS के लिए निदेशालय-1557661 (जेडीएल) द्वारा समर्थित था ।
Materials
| 3M Tape Micropore 1/2" x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m) | VWR International | 56222-182 | |
| 3mm borosilicate glass beads | Friedrich & Dimmock | GB3000B | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Biophotometer Plus | Eppendorf | E952000006 | |
| Biosafety cabinet, class II type A2 | |||
| BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene | VWR International | 47744-642 | |
| Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks | VWR International | 500029-808 | |
| cycloheximide | Research Products International | C81040-5.0 | |
| Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Dimethylformamide | |||
| Dissecting microscope (Magnification of at least 10x) | |||
| Ethanol – 190 Proof | |||
| Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom | Fisher Scientific | 08-772-3 | |
| Glass Alcohol Burner Wick | Fisher Scientific | S41898A / No. W-125 | |
| Glass Alcohol Burners | Fisher Scientific | S41898 / No. BO125 | |
| Glycerol ACS reagent | VWR International | EMGX0185-5 | |
| Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Magnesium chloride, ACS grade | VWR International | 97061-356 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade | VWR International | 97062-130 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | |||
| Microcentrifuge tubes, 2.2 mL | |||
| Mini Beadbeater-96, 115 volt | Bio Spec Products Inc. | 1001 | |
| Murashige & Skoog, Basal Salts | Caisson Laboratories, Inc. | MSP01-50LT | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL | Rainin | L8-200XLS | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL | Rainin | L8-20XLS | |
| Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish | VWR International | 89107-632 | |
| Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | FB08-757-14 | |
| Polystyrene 150x15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach) | Staples | 1013131 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology | R-120-25 | |
| Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant) | Fisher Scientific | NCO138454 | |
| Tips LTS 20 μL 960/10 GPS-L10 | Rainin | 17005091 | |
| Tips LTS 250 μL 960/10 GPS-L250 | Rainin | 17005093 | |
| VWR dissecting forceps fine tip, 4.5" | VWR International | 82027-386 |
References
- Underwood, W., Melotto, M., He, S. Y. Role of plant stomata in bacterial invasion. Cell Microbiology. 9 (7), 1621-1629 (2007).
- Zipfel, C. Early molecular events in PAMP-triggered immunity. Current Opinion in Plant Biology. 12 (4), 414-420 (2009).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Lewis, J. D., Desveaux, D., Guttman, D. S. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Seminars in Cell and Developmental Biology. 20 (9), 1055-1063 (2009).
- Schreiber, K. J., Baudin, M., Hassan, J. A., Lewis, J. D. Die another day: molecular mechanisms of effector-triggered immunity elicited by type III secreted effector proteins. Seminars in Cell and Developmental Biology. 56, 124-133 (2016).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Molecular Biology. 44 (3), 321-334 (2000).
- Boyd, L. A., Ridout, C., O’Sullivan, D. M., Leach, J. E., Leung, H. Plant-pathogen interactions: disease resistance in modern agriculture. Trends in Genetics. 29 (4), 233-240 (2013).
- Pitblado, R. E., MacNeill, B. H. Genetic basis of resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato in field tomatoes. Canadian Journal of Plant Pathology. 5 (4), 251-255 (1983).
- Pedley, K. F., Martin, G. B. Molecular basis of Pto-mediated resistance to bacterial speck disease in tomato. Annual Reviews of Phytopathology. 41, 215-243 (2003).
- Ronald, P. C., Salmeron, J. M., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. The cloned avirulence gene AvrPto induces disease resistance in tomato cultivars containing the Pto resistance gene. Journal of Bacteriology. 174 (5), 1604-1611 (1992).
- Martin, G. B., et al. Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato. Science. 262 (5138), 1432-1436 (1993).
- Salmeron, J. M., Barker, S. J., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. Tomato mutants altered in bacterial disease resistance provide evidence for a new locus controlling pathogen recognition. Plant Cell. 6 (4), 511-520 (1994).
- Salmeron, J. M., et al. Tomato Prf is a member of the leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster. Cell. 86 (1), 123-133 (1996).
- Scofield, S. R., et al. Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato. Science. 274 (5295), 2063-2065 (1996).
- Kunkeaw, S., Tan, S., Coaker, G. Molecular and evolutionary analyses of Pseudomonas syringae pv. tomato race 1. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (4), 415-424 (2010).
- Cai, R., et al. The plant pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato is genetically monomorphic and under strong selection to evade tomato immunity. PLoS Pathogens. 7 (8), 1002130 (2011).
- Almeida, N. F., et al. A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Molecular Plant-Microbe Interactions. 22 (1), 52-62 (2009).
- Lin, N. C., Abramovitch, R. B., Kim, Y. J., Martin, G. B. Diverse AvrPtoB homologs from several Pseudomonas syringae pathovars elicit Pto-dependent resistance and have similar virulence activities. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 702-712 (2006).
- Rose, L. E., Langley, C. H., Bernal, A. J., Michelmore, R. W. Natural variation in the Pto pathogen resistance gene within species of wild tomato (Lycopersicon). I. Functional analysis of Pto alleles. Génétique. 171 (1), 345-357 (2005).
- Thapa, S. P., Miyao, E. M., Davis, R. M., Coaker, G. Identification of QTLs controlling resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1 strains from the wild tomato Solanum habrochaites LA1777. Theoretical and Applied Genetics. 128 (4), 681-692 (2015).
- Bao, Z. L., et al. Identification of a candidate gene in Solanum habrochaites for resistance to a race 1 strain of Pseudomonas syringae pv. tomato. Plant Genome. 8 (3), 1-15 (2015).
- Hassan, J. A., Zhou, Y. J., Lewis, J. D. A rapid seedling resistance assay identifies wild tomato lines that are resistant to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1. Molecular Plant-Microbe Interactions. 30 (9), 701-709 (2017).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 44 (2), 301-307 (1954).
- Uppalapati, S. R., et al. Pathogenicity of Pseudomonas syringae pv. tomato on tomato seedlings: phenotypic and gene expression analyses of the virulence function of coronatine. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (4), 383-395 (2008).
- Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock. PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).
- Lu, H., McClung, C. R., Zhang, C. Tick tock: circadian regulation of plant innate immunity. Annual Review of Phytopathology. 55, 287-311 (2017).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Nature. 470 (7332), 110-114 (2011).
