Høy-gjennomstrømning identifikasjon av motstand mot Pseudomonas syringae pv. Tomat i tomat ved hjelp av frøplanteflomanalyse
Summary
Frøplanteflomanalysen letter rask screening av villtomattiltredelse for motstanden mot Pseudomonas syringae bakterien. Denne analysen, som brukes sammen med frøplante bakteriell vekst analyse, kan bidra til ytterligere karakterisere den underliggende motstanden mot bakterien, og kan brukes til å screene kartlegging populasjoner for å bestemme det genetiske grunnlaget for resistens.
Abstract
Tomat er en agronomically viktig avling som kan bli smittet av Pseudomonas syringae, en Gram-negativ bakterie, noe som resulterer i bakteriell flekksykdom. Tomat-P. syringae pv. tomat patosystem er mye brukt til å dissekere det genetiske grunnlaget for plantemedfødte responser og sykdomsresistens. Mens sykdommen ble vellykket forvaltet i mange tiår gjennom innføringen av Pto / Prf genklyngen fra Solanum pimpinellifolium til dyrket tomat, rase 1 stammer av P. syringae har utviklet seg til å overvinne motstand overdratt av Pto / Prf genklyngen og forekommer over hele verden.
Ville tomatarter er viktige reservoarer av naturlig mangfold i patogenanerkjennelse, fordi de utviklet seg i ulike miljøer med ulike patogentrykk. I typiske skjermer for sykdomsresistens i vill tomat brukes voksne planter, noe som kan begrense antall planter som kan screenes på grunn av utvidet veksttid og større vekstplasskrav. Vi utviklet en metode for å screene 10-dagers gamle tomatfrøplanter for motstand, noe som minimerer planteveksttid og vekstkammerplass, gjør det mulig å teste store utvalgsstørrelser. Frøplanteutfall av overlevelse eller død kan behandles som diskrete fenotyper eller på en motstandsskala definert av mengden ny vekst i overlevende frøplanter etter flom. Denne metoden er optimalisert for å screene 10-dagers gamle tomatfrøplanter for motstand mot to P. syringae stammer og kan lett tilpasses andre P. syringae stammer.
Introduction
Pseudomonas syringae er en Gram-negativ patogen bakterie som infiserer et bredt spekter av planteverter. Bakterier kommer inn i vertsanlegget gjennom stomata eller fysiske sår og sprer seg i apoplast1. Planter har utviklet en todelt immunrespons for å beskytte mot infeksjon av bakterielle patogener. Det første nivået oppstår på plantecelleoverflaten, hvor mønstergjenkjenningsreseptorer på plantecellemembranen oppfatter svært bevarte patogenetilhørende molekylære mønstre (PAMPs) i en prosess som kalles PAMP-utløst immunitet (PTI)2. I løpet av denne prosessen regulerer vertsanlegget forsvarsresponsveier, inkludert avsetning av callose til celleveggen, lukking av stomata, produksjon av reaktive oksygenarter og induksjon av patogeneserelaterte gener.
Bakterier kan overvinne PTI ved å bruke en type III sekresjonssystem for å levere proteiner, kalt effektorer, direkte inn i plantecellen3. Effector proteiner vanligvis målrette komponenter av PTI og fremme patogen virulence4. Den andre delen av planteimmunitet oppstår i plantecellen ved anerkjennelse av effektorproteinene. Denne anerkjennelsen er avhengig av resistensgener, som koder nukleotidbindende sted leucine-rik repetisjon som inneholder reseptorer (NLRs). NLRs er i stand til enten å gjenkjenne effektorer direkte eller gjenkjenne sin aktivitet på et virulensmål eller lokkedue5. De utløser deretter en sekundær immunrespons i en prosess som kalles effektorutløst immunitet (ETI), som ofte er forbundet med en overfølsom respons (HR), en form for lokalisert celledød på infeksjonsstedet6. I motsetning til gen-for-genresistens forbundet med ETI, kan planter vise kvantitativ delvis motstand, som er avhengig av bidrag fra flere gener7.
P. syringae pv. tomat (PST) er årsaksmiddelet av bakteriell flekk på tomat og er et vedvarende landbruksproblem. Dominerende stammer i feltet har vanligvis vært Pst rase 0 stammer som uttrykker enten eller begge av typen III effektorer AvrPto og AvrPtoB. DC3000 (PstDC3000) er en representativ rase 0 belastning og en modell patogen som kan forårsake bakteriell flekk i tomat. For å bekjempe bakteriell flekksykdom, gikk oppdrettere inn i Pto [P. syringae pv. tomat]/ Prf [Pto motstand og fenthion følsomhet] genklynge fra de ville tomatartene Solanum pimpinellifolium i moderne sorter8,9. Pto genet koder en serin-threoninprotein kinase som, sammen med Prf NLR, gir motstand mot PSTDC3000 via anerkjennelse av effektorene AvrPto og AvrPtoB10,11,12,13,14. Denne motstanden er imidlertid ineffektiv mot nye løp 1 stammer, slik at for deres raske og aggressive spredning de siste årene15,16. Race 1 stammer unngå anerkjennelse av Pto / Prf klyngen, fordi AvrPto er enten tapt eller mutert i disse stammene, og AvrPtoB ser ut til å samle minimalt15,17,18.
Villtomatpopulasjoner er viktige reservoarer av naturlig variasjon for PST-resistens og har tidligere blitt brukt til å identifisere potensiell motstand loci19,20,21. Dagens skjermer for patogenresistens benytter imidlertid 4–5 uker gamle voksne planter20,21. Derfor er de begrenset av veksttid, vekstkammerplass og relativt små utvalgsstørrelser. For å løse begrensningene av konvensjonelle tilnærminger, utviklet vi en høy gjennomstrømning tomat P. syringae motstand analyse ved hjelp av 10-dagers gamle tomat frøplanter22. Denne tilnærmingen gir flere fordeler ved bruk av voksne planter: nemlig kortere veksttid, reduserte romkrav og høyere gjennomstrømning. Videre har vi vist at denne tilnærmingen trofast rekapitulerer sykdomsresistens fenotyper observert i voksne planter22.
I frøplanteflomanalysen beskrevet i denne protokollen dyrkes tomatfrøplanter på Petri-retter av sterile Murashige og Skoog (MS) medier i 10 dager og blir deretter oversvømmet med et inokulum som inneholder bakterier av interesse og et overflateaktivt middel. Etter flom kan frøplanter evalueres kvantitativt for sykdomsresistens via bakteriell vekstanalyser. I tillegg kan frøplante overlevelse eller død fungere som en diskret resistens eller sykdom fenotype 7-14 dager etter flom. Denne tilnærmingen tilbyr et høygjennomstrømningsalternativ for screening av et stort antall villtomattiltredelseer for motstand mot PST-løp 1 stammer, for eksempel PST-stamme T1 (PstT1), og kan enkelt tilpasses andre bakterielle stammer av interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
En protokoll for flom inokulasjon med PSTDC3000 eller PstT1 optimalisert for å oppdage motstand mot disse bakterielle stammer i tomat frøplanter er beskrevet. Det er flere kritiske parametere for optimale resultater i frøplanteresistensanalysen, inkludert bakteriell konsentrasjon og overflateaktivt konsentrasjon, som empirisk ble bestemt22. For PSTDC3000 ble den optiske tettheten optimalisert for å oppnå fullstendig overlevelse på en motstandsdyktig sort som inneho…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Jamie Calma for å teste effekten av medievolum på sykdom eller resistensutfall. Vi takker Dr. Maël Baudin og Dr. Karl J. Scheiber fra Lewis Lab for å gi konstruktive kommentarer og forslag til manuskriptet. Forskning på planteimmunitet i Lewis-laboratoriet ble støttet av USDA ARS 2030-21000-046-00D og 2030-21000-050-00D (JDL), og NSF Direktoratet for biologiske vitenskaper IOS-1557661 (JDL).
Materials
| 3M Tape Micropore 1/2" x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m) | VWR International | 56222-182 | |
| 3mm borosilicate glass beads | Friedrich & Dimmock | GB3000B | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Biophotometer Plus | Eppendorf | E952000006 | |
| Biosafety cabinet, class II type A2 | |||
| BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene | VWR International | 47744-642 | |
| Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks | VWR International | 500029-808 | |
| cycloheximide | Research Products International | C81040-5.0 | |
| Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Dimethylformamide | |||
| Dissecting microscope (Magnification of at least 10x) | |||
| Ethanol – 190 Proof | |||
| Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom | Fisher Scientific | 08-772-3 | |
| Glass Alcohol Burner Wick | Fisher Scientific | S41898A / No. W-125 | |
| Glass Alcohol Burners | Fisher Scientific | S41898 / No. BO125 | |
| Glycerol ACS reagent | VWR International | EMGX0185-5 | |
| Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Magnesium chloride, ACS grade | VWR International | 97061-356 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade | VWR International | 97062-130 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | |||
| Microcentrifuge tubes, 2.2 mL | |||
| Mini Beadbeater-96, 115 volt | Bio Spec Products Inc. | 1001 | |
| Murashige & Skoog, Basal Salts | Caisson Laboratories, Inc. | MSP01-50LT | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL | Rainin | L8-200XLS | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL | Rainin | L8-20XLS | |
| Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish | VWR International | 89107-632 | |
| Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | FB08-757-14 | |
| Polystyrene 150x15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach) | Staples | 1013131 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology | R-120-25 | |
| Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant) | Fisher Scientific | NCO138454 | |
| Tips LTS 20 μL 960/10 GPS-L10 | Rainin | 17005091 | |
| Tips LTS 250 μL 960/10 GPS-L250 | Rainin | 17005093 | |
| VWR dissecting forceps fine tip, 4.5" | VWR International | 82027-386 |
References
- Underwood, W., Melotto, M., He, S. Y. Role of plant stomata in bacterial invasion. Cell Microbiology. 9 (7), 1621-1629 (2007).
- Zipfel, C. Early molecular events in PAMP-triggered immunity. Current Opinion in Plant Biology. 12 (4), 414-420 (2009).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Lewis, J. D., Desveaux, D., Guttman, D. S. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Seminars in Cell and Developmental Biology. 20 (9), 1055-1063 (2009).
- Schreiber, K. J., Baudin, M., Hassan, J. A., Lewis, J. D. Die another day: molecular mechanisms of effector-triggered immunity elicited by type III secreted effector proteins. Seminars in Cell and Developmental Biology. 56, 124-133 (2016).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Molecular Biology. 44 (3), 321-334 (2000).
- Boyd, L. A., Ridout, C., O’Sullivan, D. M., Leach, J. E., Leung, H. Plant-pathogen interactions: disease resistance in modern agriculture. Trends in Genetics. 29 (4), 233-240 (2013).
- Pitblado, R. E., MacNeill, B. H. Genetic basis of resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato in field tomatoes. Canadian Journal of Plant Pathology. 5 (4), 251-255 (1983).
- Pedley, K. F., Martin, G. B. Molecular basis of Pto-mediated resistance to bacterial speck disease in tomato. Annual Reviews of Phytopathology. 41, 215-243 (2003).
- Ronald, P. C., Salmeron, J. M., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. The cloned avirulence gene AvrPto induces disease resistance in tomato cultivars containing the Pto resistance gene. Journal of Bacteriology. 174 (5), 1604-1611 (1992).
- Martin, G. B., et al. Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato. Science. 262 (5138), 1432-1436 (1993).
- Salmeron, J. M., Barker, S. J., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. Tomato mutants altered in bacterial disease resistance provide evidence for a new locus controlling pathogen recognition. Plant Cell. 6 (4), 511-520 (1994).
- Salmeron, J. M., et al. Tomato Prf is a member of the leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster. Cell. 86 (1), 123-133 (1996).
- Scofield, S. R., et al. Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato. Science. 274 (5295), 2063-2065 (1996).
- Kunkeaw, S., Tan, S., Coaker, G. Molecular and evolutionary analyses of Pseudomonas syringae pv. tomato race 1. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (4), 415-424 (2010).
- Cai, R., et al. The plant pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato is genetically monomorphic and under strong selection to evade tomato immunity. PLoS Pathogens. 7 (8), 1002130 (2011).
- Almeida, N. F., et al. A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Molecular Plant-Microbe Interactions. 22 (1), 52-62 (2009).
- Lin, N. C., Abramovitch, R. B., Kim, Y. J., Martin, G. B. Diverse AvrPtoB homologs from several Pseudomonas syringae pathovars elicit Pto-dependent resistance and have similar virulence activities. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 702-712 (2006).
- Rose, L. E., Langley, C. H., Bernal, A. J., Michelmore, R. W. Natural variation in the Pto pathogen resistance gene within species of wild tomato (Lycopersicon). I. Functional analysis of Pto alleles. Génétique. 171 (1), 345-357 (2005).
- Thapa, S. P., Miyao, E. M., Davis, R. M., Coaker, G. Identification of QTLs controlling resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1 strains from the wild tomato Solanum habrochaites LA1777. Theoretical and Applied Genetics. 128 (4), 681-692 (2015).
- Bao, Z. L., et al. Identification of a candidate gene in Solanum habrochaites for resistance to a race 1 strain of Pseudomonas syringae pv. tomato. Plant Genome. 8 (3), 1-15 (2015).
- Hassan, J. A., Zhou, Y. J., Lewis, J. D. A rapid seedling resistance assay identifies wild tomato lines that are resistant to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1. Molecular Plant-Microbe Interactions. 30 (9), 701-709 (2017).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 44 (2), 301-307 (1954).
- Uppalapati, S. R., et al. Pathogenicity of Pseudomonas syringae pv. tomato on tomato seedlings: phenotypic and gene expression analyses of the virulence function of coronatine. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (4), 383-395 (2008).
- Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock. PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).
- Lu, H., McClung, C. R., Zhang, C. Tick tock: circadian regulation of plant innate immunity. Annual Review of Phytopathology. 55, 287-311 (2017).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Nature. 470 (7332), 110-114 (2011).
