Användning av frysta upptinade embryon för högeffektiv produktion av genetiskt modifierade möss
Summary
Här presenterar vi en modifierad metod för kryokonservering av encelliga embryon samt ett protokoll som kopplar användningen av frysta-tinade embryon och elektroporation för effektiv generation av genetiskt modifierade möss.
Abstract
Användningen av genetiskt modifierade (GM) möss har blivit avgörande för att förstå genfunktionen och dechiffrera de underliggande mekanismerna för mänskliga sjukdomar. CRISPR/Cas9-systemet gör det möjligt för forskare att ändra genomet med oöverträffad effektivitet, trohet och enkelhet. Utnyttja denna teknik, forskare söker en snabb, effektiv och enkelt protokoll för att generera GM möss. Här introducerar vi en förbättrad metod för kryokonservering av encelliga embryon som leder till en högre utvecklingstakt av de frysta upptinade embryona. Genom att kombinera det med optimerade elektroporationsförhållanden möjliggör detta protokoll generering av knockout- och knock-in-möss med hög effektivitet och låga mosaikhastigheter inom en kort tid. Dessutom visar vi en steg-för-steg-förklaring av vårt optimerade protokoll, som omfattar CRISPR-reagensberedning, provspisbefruktning, kryokonservering och upptining av encelliga embryon, elektroporation av CRISPR-reagenser, musgenerering och genotypning av grundarna. Med hjälp av detta protokoll bör forskare kunna förbereda GM-möss med oöverträffad lätthet, hastighet och effektivitet.
Introduction
Det klustrade regelbundet interspaced korta palindromic repetitioner (CRISPR)/CRISPR-associerade protein 9 (Cas9) systemet är ett vetenskapligt genombrott som ger oöverträffad riktad modifiering i genomet1. CRISPR/Cas9-systemet består av Cas9-protein och styr RNA (gRNA) med två molekylära komponenter: ett målspecifik CRISPR RNA (crRNA) och ett transaktiverande CRISPR RNA (tracrRNA)2 . Ett gRNA riktar Cas9-proteinet mot den specifika locus i genomet, 20 nukleotider som kompletterar crRNA och intill protospacer intilliggande motiv (PAM). Cas9-proteinet binder till målsekvensen och inducerar dubbelsträngsbrott (DSB) som repareras av antingen felbenägna nonhomologous end joining (NHEJ) eller high fidelity homology-directed repair (HDR)3,4,5. NHEJ leder till infogningar eller/och borttagningar (indels), och därmed till genförlust av funktion när en kodningssekvens är riktad. HDR leder till exakt genomredigering i närvaro av en reparationsmall som innehåller homologisekvenser3,,4,5. NHEJ och HDR har utnyttjats för att generera knockout och knock-in möss, respektive.
Crispr/Cas9-systemet har accelererat produktionen av GM-möss med enastående effekt och trohet, men forskare som tillämpar dessa metoder stöter ofta på tekniska utmaningar. För det första kräver konventionella protokoll mikroinjektion för att införa CRISPR-redigeringsverktygen i pronucleusen av befruktade ägg6,7. Denna teknik är tidskrävande och kräver vanligtvis omfattande utbildning. Således ersatte flera grupper mikroinjektion med elektroporation8,9,10,11,12,13. I de tidiga elektroporation protokollen färska embryon användes för elektroporation. Detta orsakade ett annat problem, eftersom förbereda färska embryon före varje experiment är svårt14.
Nyligen har vi och andra kombinerat användningen av frysta-tinade embryon och elektroporation för genomredigering, vilket underlättar uppkomsten av GM möss15,16. Detta protokoll gör det möjligt för forskare utan avancerad embryomanipulationsförmåga att snabbt generera djurmodeller av mänskliga sjukdomar med hög effektivitet. Protokollet minskar också avsevärt praktiska utmaningar i att generera GM möss, såsom genetisk heterogenitet i grundarna16. För att övervinna mosaicism utför vi elektroporation av CRISPR-reagenser inom 1 h efter embryoupptining för att säkerställa att redigering sker före den första replikeringen av genomet. En annan förbättring inkluderar användningen av Cas9 protein istället för Cas9 mRNA för att minska oönskad mosaicism17. Dessutom utvecklade vi en optimal metod för en-cell embryo cryopreservation som ökar utvecklingstakten till två-cell steg16:användning av fetala nötkreatur serum (FBS) dramatiskt förbättrar överlevnaden av fryst-tinade äggceller efter befruktning, kanske med samma mekanism som gör fryst-tinade ofertiliserade oocyter mer motståndskraftiga18.
Här presenterar vi ett omfattande protokoll för generering av GM-möss med frysta-tinade embryon, inklusive den modifierade metoden för cryopreservation av en-cell C57BL/6J embryon. Den innehåller 1) gRNA-design, CRISPR-reagensberedning och montering; 2) IVF, kryobevarande och upptining av encelliga embryon; 3) Elektroporering av CRISPR-reagenser till fryst tinade embryon. 4) Embryoöverföring till oviduct av pseudopregnant kvinnliga möss; och 5) Genotypning och sekvensanalys av F0-grundarnas djur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det beskrivna protokollet möjliggör generering av genetiskt modifierade möss med hög effektivitet och låga mosaikhastigheter (tabell 1). Det gör det möjligt för forskare utan avancerade embryo manipulation färdigheter för att skapa muterade möss lätt eftersom det drar nytta av de senaste och mest användbara framsteg inom både reproduktiv teknik och genomet redigeringsteknik: CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) och elektroporation i frysta-tinade embryon. Dessa framsteg underlättade och på…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Hitomi Sawada och Elizabeth Garcia för djurvård. Detta arbete stöddes av KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 och 16K01946) och Hokugin Research Grant (till H.N.), och Jichi Medical University Young Investigator Award (till H.U.). Otsuka Toshimi Scholarship Foundation stödde M.D.
Materials
| 0.25 M Sucrose | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | SUCROSE | |
| 1 M DMSO | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | 1M DMSO | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | Vetorphale 5mg | |
| Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1081060 | |
| C57BL/6J mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| DAP213 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | DAP213 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | ES-009-C | |
| hCG | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) | HCG Mochida 3000 | |
| HTF | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | HTF | |
| ICR mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| Isoflurane | Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) | 07-893-1389 | |
| KSOM | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | KSOM | |
| LN2 Tank | Chart Industries (Ball Ground, GA) | XC 34/18 | |
| M2 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | M2 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) | 1124401A1060 | |
| Microscope | Nikon Co. (Tokyo, Japan) | SMZ745T | |
| Midazolam | Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) | 1124401A1060 | |
| Nuclease free buffer | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1072570 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) | 740952 .5 | |
| One-hole slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) | S339929 | |
| One-step type Electroporator | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | CUY21EDIT II | |
| Paraffin Liquid | NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) | SP 26137-85 | |
| Platinum plate electrode | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | LF501PT1-10, GE-101 | |
| PMSG | ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) | SEROTROPIN 1000 | |
| Povidone iodide | Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) | C12400 | |
| Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | 22600134 | |
| Two-step type Electroporator | Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) | NEPA21 |
References
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA – guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Biologie du développement. 393 (1), 3-9 (2014).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Génétique. 200 (2), 423-430 (2015).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
- Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Biologie du développement. 418 (1), 1-9 (2016).
- Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. Bio-ingénierie. 6 (3), 63 (2019).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811 (2019).
- Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
- Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
- Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
- Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973 (2016).
- Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
- Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
- Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).
