طريقة الثقافة المشتركة لدراسة النيرايت الناء في الاستجابة لإشارات اللب الأسنان باراكرين
Summary
نحن نصف العزلة والتشتت والطلاء من الخلايا الأولية لب الأسنان (DP) مع الخلايا العصبية ثلاثية التوائم (TG) المستزرعة فوق مرشحات عبر ويل فوق. يمكن تحليل الاستجابات الخلوية لخلايا DP مع الفلور المناعي أو تحليل الحمض النووي الريبي / البروتين. الفلور المناعي من علامات الخلايا العصبية مع المجهر المعالبؤر يسمح تحليل استجابات نمو النيوتر.
Abstract
يسمح تعصيب الأسنان للأسنان باستشعار الضغط ودرجة الحرارة والالتهاب ، وكلها حاسمة لاستخدام وصيانة جهاز الأسنان. بدون تعصيب حسي ، فإن الأنشطة الشفوية اليومية ستسبب ضررًا لا يمكن إصلاحه. على الرغم من أهميتها ، تم تجاهل أدوار التعصيب في تطوير الأسنان وصيانتها إلى حد كبير. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن خلايا DP تفرز بروتينات مصفوفة خارج الخلية وإشارات الباراكرين لجذب وتوجيه محاور TG في جميع أنحاء السن. ومع ذلك ، قدمت دراسات قليلة نظرة مفصلة في الحديث المتبادل بين mesenchyme DP والخلايا العصبية afferents. ولمعالجة هذه الفجوة في المعرفة، بدأ الباحثون في استخدام الثقافات المشتركة ومجموعة متنوعة من التقنيات للتحقيق في هذه التفاعلات. هنا، ونحن نشرح الخطوات المتعددة المشاركة في الزراعة المشتركة الخلايا DP الأولية مع الخلايا العصبية TG المنتشرة على مرشح عبر ويل فوقمع المسام قطرها كبيرة للسماح نمو محور عصبي من خلال المسام. تم استخدام خلايا DP الأولية مع جين الفائدة محاطة بمواقع loxP لتسهيل حذف الجينات باستخدام نظام الـ Adenovirus-Cre-GFP recombinase. باستخدام الخلايا العصبية TG من الماوس Thy1-YFP يسمح للتصوير afferent دقيقة، مع التعبير أعلى بكثير من مستويات الخلفية عن طريق المجهر confocal. يمكن التحقيق في استجابات DP من خلال جمع وتحليل البروتين أو الحمض النووي الريبي ، أو بدلاً من ذلك ، من خلال تلطيخ الفلورسنت المناعي لخلايا DP المطلية على قسائم الأغطية الزجاجية القابلة للإزالة. يمكن تحليل وسائل الإعلام باستخدام تقنيات مثل التحليلات البروتينية ، على الرغم من أن هذا سيتطلب استنفاد الزلال بسبب وجود مصل الأبقار الجنينفي في وسائل الإعلام. يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة يمكن التلاعب بها لدراسة الاستجابات المورفولوجية والوراثية والهيكلية للخلايا العصبية TG وخلايا DP استجابة للبيئة الخاضعة للرقابة من تحليل الثقافة المشتركة.
Introduction
يسمح تعصيب الأسنان للأسنان باستشعار الضغط ودرجة الحرارة والالتهاب ، وكلها حاسمة لاستخدام وصيانة جهاز الأسنان. يؤدي الفشل في الشعور بألم الأسنان المرتبط بتسوس الأسنان والصدمات النفسية إلى تطور المرض. وبالتالي ، فإن التعصيب السليم هو شرط لنمو الأسنان العادية ، وظيفة والرعاية.
في حين أن معظم الأجهزة تعمل بكامل طاقتها وتُدمج بحلول وقت الولادة ، فإن تطور الأسنان يمتد إلى حياة البالغين ، مع تعصيب الأسنان والتمعدن الذي يحدث بالتنسيق خلال مراحل ما بعد الولادة1،2. ومن المثير للاهتمام أن اللب الأسنان (DP) mesenchyme تفرز في البداية إشارات طاردة أثناء تكوين الأجنة لمنع دخول محور عصبي إلى جهاز الأسنان النامية ، والتي تتحول في وقت لاحق إلى إفراز عوامل جذب مع اقتراب الأسنان من ثوران3،4. خلال مراحل ما بعد الولادة ، تخترق المحاور المحورية من العصب الثلاثي التوائم (TG) في الأسنان وفي جميع أنحاء هافيالوقت الذي يبدأ فيه ترسب دنتين (تمت مراجعته في باجيلا ، P. وآخرون5). وقد أظهرت العديد من الدراسات في الجسم الحي أن التفاعلات العصبية-mesenchymal دليل تعصيب الأسنان في الفئران (استعرضت في لوكو، K. وآخرون6)،ولكن تفاصيل قليلة من الآليات الجزيئية المتاحة.
توفر الثقافات المشتركة للخلايا بيئات خاضعة للرقابة حيث يمكن للمحققين التعامل مع التفاعلات بين الخلايا العصبية والسكان الميسينشيم. تجعل تجارب الثقافة المشتركة من الممكن التعمق في مسارات الإشارات التي توجه تعصيب الأسنان وتطورها. ومع ذلك، فإن العديد من الأساليب التقليدية المستخدمة لدراسة الخلايا في الثقافة المشتركة تطرح تحديات تقنية. على سبيل المثال، يمكن تلطيخ الكريستال البنفسجي من النيوريت outgrowth غير محددة وصمة عار شوان الخلايا المدرجة في تشتت حزمة TG، وربما يكون هناك قمم في كثافة اللون مع استجابات صغيرة نسبيا7. تقدم غرف Microfluidic خيارًا جذابًا ، ولكنها أكثر تكلفة بكثير من مرشحات ترانسويل8،9 وتسمح فقط بالتحقيق في استجابات الخلايا العصبية لإفرازات DP. لمعالجة هذه القضايا، وضعنا بروتوكوليسمح ل: أ) تلطيخ دقيق والتصوير من نمو TG neurite استجابة لإفرازات DP، ب) التعديل الوراثي للخلايا DP و / أو الخلايا العصبية TG للتحقيق في مسارات إشارة محددة، و ج) التحقيق في استجابات خلايا DP للعوامل التي تفرزها الخلايا العصبية TG. يوفر هذا البروتوكول القدرة على التحقيق بدقة في العديد من ميزات تعصيب الأسنان في البيئة الخاضعة للرقابة في فحص الثقافة المشتركة في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتطلب الأنشطة اليومية لتجويف الفم أن تستشعر الأسنان المحفزات الخارجية والالتهاب اتّهات داخليًا من أجل السماح بالاستخدام السليم والصيانة. ومع ذلك ، لا تتوفر سوى معلومات محدودة بشأن الإشارات التي تحرك عمليات تطوير تعصيب الأسنان. يوفر هذا البروتوكول طريقة لعزل والمشاركة في زراعة خلايا DP ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل أ) المعاهد الوطنية للصحة / NIAMS (أرقام المنحR01 AR062507 و R01 AR053860 إلى RS) ، ب) جامعة ألاباما في برمنغهام التدريب الأكاديمي للبحوث الأكاديمية (DART) منحة (رقم T90DE0022736 (PI MacDougall)) إلى SBP من المعهد الوطني لبحوث الأسنان والعناية بالجمجمة / المعاهد الوطنية للصحة ، ج) مركز الجامعة العربية العربية العالمي لاضطرابات الوجه القحفي والفم والأسنان (GC-CODED) نموذج تجريبي ومنحة جدوى لSBP و d) المعهد الوطني لطب الأسنان والوجه القحفي البحوث / المعاهد الوطنية للصحة K99 DE024406 منحة إلى SBP.
Materials
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
References
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
- Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp. Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).
- Luukko, K., Kettunen, P. Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A. Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).
- Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. Assay for neurite outgrowth quantification. BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).
- de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism. Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).
- Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).
- Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV. Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).
- Caroni, P. Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).
- Alić, I., et al. Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology. Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).
- Howroyd, P. C. Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. , (2019).
- Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons. Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).
- Liu, R., Lin, G., Xu, H. An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment. PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).
- Burry, R. W. Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures. Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).
- Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in molecular biology. 1656, 229-251 (2017).
- Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).
- Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro. Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth. Scientific reports. 6, 31799 (2016).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).
- Miura, T., Yokokawa, R. Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices. Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).
