Une méthode de co-culture pour étudier la croissance de la neurite en réponse aux signaux dentaires de paracrine de pulpe

Summary

Nous décrivons l’isolement, la dispersion et le placage des cellules primaires de pulpe dentaire (DP) avec les neurones trigéminaux (TG) cultivés au-dessus des filtres transwell. Les réponses cellulaires des cellules DP peuvent être analysées avec l’immunofluorescence ou l’analyse d’ARN/protéine. L’immunofluorescence des marqueurs neuronaux avec la microscopie confocale permet l’analyse des réponses de excroissance neurite.

Abstract

L’innervation des dents permet aux dents de sentir la pression, la température et l’inflammation, qui sont toutes cruciales pour l’utilisation et l’entretien de l’organe dentaire. Sans innervation sensorielle, les activités orales quotidiennes causeraient des dommages irréparables. Malgré son importance, les rôles de l’innervation dans le développement et l’entretien des dents ont été largement négligés. Plusieurs études ont démontré que les cellules DP sécrètent des protéines de matrice extracellulaire et des signaux paracrines pour attirer et guider les axones TG dans et tout au long de la dent. Cependant, peu d’études ont fourni un aperçu détaillé dans le crosstalk entre le mesenchyme DeP et les afferents neuronaux. Pour combler cette lacune dans les connaissances, les chercheurs ont commencé à utiliser des co-cultures et une variété de techniques pour étudier ces interactions. Ici, nous démontrons les étapes multiples impliquées dans la co-culture des cellules primaires de DP avec des neurones de TG dispersés sur un filtre de transwell sus-lying avec des pores de grand diamètre pour permettre la croissance axonale par les pores. Des cellules primaires de DP avec le gène d’intérêt flanqué des emplacements de loxP ont été employées pour faciliter la suppression de gène utilisant un système de recombinase d’Adenovirus-Cre-GFP. L’utilisation des neurones TG de la souris Thy1-YFP a permis une imagerie afferente précise, avec une expression bien au-dessus des niveaux de fond par microscopie confocale. Les réponses dP peuvent être étudiées par la collecte et l’analyse de protéine ou d’ARN, ou alternativement, par la coloration immunofluorescente des cellules de DP plaquées sur des couvertures en verre amovibles. Les médias peuvent être analysés à l’aide de techniques telles que les analyses protéomiques, bien que cela nécessitera l’épuisement de l’albumine en raison de la présence de sérum bovin fœtal dans les médias. Ce protocole fournit une méthode simple qui peut être manipulée pour étudier les réponses morphologiques, génétiques et cytosquelettiques des neurones TG et des cellules DP en réponse à l’environnement contrôlé d’un test de co-culture.

Introduction

L’innervation des dents permet aux dents de sentir la pression, la température et l’inflammation, qui sont toutes cruciales pour l’utilisation et l’entretien de l’organe dentaire. Le fait de ne pas sentir la douleur dentaire associée aux caries dentaires et aux traumatismes entraîne une progression de la maladie. Ainsi, l’innervation appropriée est une exigence pour la croissance normale de dent, la fonction et les soins.

Alors que la plupart des organes sont entièrement fonctionnels et innervés au moment de la naissance, le développement des dents s’étend à la vie adulte, avec l’innervation des dents et la minéralisation se produisant de c....

Protocol

Toutes les expériences sur des souris ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’UAB.

1. Préparation des plaques

REMARQUE : Les fiches de couverture peuvent être utilisées pour imager les cellules DP à la fin de l’analyse. Assurez-vous que le couvercle de la plaque est allumé pendant toutes les étapes d’incubation et de rinçant à l’extérieur du capuchon de culture de tissu stérile pour empêcher la contamination pendant le traitement d’échantillon.

1. Préparation de la glissade de couverture
   1. Couvertures circulaires automatiq....

Results

Ces résultats montrent que la croissance de neurite de TG a été augmentée en présence des cellules primaires de DP dans le puits sous-jacent comparé au contrôle de la monoculture de neurite de TG (figure 2A,C). Il y a une certaine variabilité d’assay-to-assay dans la croissance neurite. Ainsi, une monoculture de neurones TG devrait être incluse dans toutes les analyses comme un contrôle pour détecter les niveaux basaux de la croissance neurite. Des cellules primaires de la s.......

Discussion

Les activités quotidiennes de la cavité buccale exigent que les dents sentent des stimuli externes et une inflammation interne afin de permettre une utilisation et un entretien appropriés. Cependant, seulement peu d’information est disponible concernant les signaux qui conduisent les processus développementaux de l’innervation de dent. Ce protocole fournit une méthode pour isoler et co-culture des cellules primaires DP et des neurones TG afin d’étudier la communication croisée entre les deux populations. Plusieurs variab.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2'-désoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503	Utilisé comme inhibiteur mitotique à 15 &mu ; Concentration M dans les milieux de co-culture, Jour 2
Plaque de culture cellulaire à 24 puits Corning		3524	Plaque de co-culture
Alexa-546 Anti-poulet	Invitrogen	A-11040	Secondaire à la croissance de neurite de coloration marquée par un anticorps anti-GFP, dilution 1:500
Anticorps anti-GFP	Aves Lab, Inc	GFP-1010	Anticorps primaire pour marquer les neurones Thy1-YFP, dilution 1:200
Anti-Neurofilament 200 anticorps	Sigma-Aldrich	NO142	Anticorps primaire monoclonal pour marquer les neurones, dilution 1:1000, alternative si les souris YFP ne sont pas disponibles
B6 ; 129- Tgfbr2tm1Karl/J	The Jackson Laboratory	12603	Tgfbr2f/f modèle murin utilisé pour les cellules de la pulpe dentaire dans le protocole optimisé
B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J	The Jackson Laboratory	3709	Génotype modèle de souris Thy1-YFP utilisé pour les neurones du trijumeau
Collagénase de type II	Millipore	234155-100MG	Utilisé pour disperser les neurones du trijumeau
Sérum de bovin fœtal	Gibco	10437	Additif aux milieux de co-culture
Pince fine	Outils de science fine	11413-11	Pince fine pour la dissection TG
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	recouvre les inserts de transpuits à une concentration finale de 10 &mu ; g/ml, la solution mère est supposée à 1,5 mg/ml
Tampon de lyse (Buffer RLT)	Qiagen	79216	Extrait l’ARN des cellules de la pulpe dentaire après co-culture
L-Glutamine	Gibco 25030081		Additif aux milieux de co-culture
Ciseaux de micro-dissection	Sigma-Aldrich	S3146-1EA	Ciseaux de dissection pour ouvrir le crâne
Couvercle de microscope Verre	Fisherbrand	12-545-81	Lamelle circulaire pour la culture cellulaire et le traitement par immunofluorescence en option
Milieu essentiel minimal a	Gibco	12571063	Base de milieu de co-culture
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15070063	Additif antibiotique dans le milieu de co-culture
Inhibiteur de phosphatase	Sigma-Aldrich	04 906 837 001	Additif dans le tampon RIPA pour l’extraction de protéines à partir de cellules de pulpe dentaire co-culture
Polybrene	Millipore	TR-1003-G	Utilisé pour aider à la transfection cellulaire de la pulpe dentaire
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280	Revêtement de lamelle pour faciliter l’adhésion cellulaire de la pulpe dentaire
Inhibiteurs de protéase	Millipore	05 892 791 001	Additif au tampon RIPA pour l’extraction des protéines des cellules de la pulpe dentaire après co-culture
Tubes eppendorf libres ARN/ADN	Denville	C-2172	Tubes préstérilisés de 1,7 ml pour la collecte d’ARN, d’ADN ou de protéines à la fin du test
ThinCert Insert de culture cellulaire	Greiner Bio-One	662631	Transwell pour les neurones trigéminaux dans les tests de co-culture
Trypsin-EDTA (0,25 %)	Gibco	25200056	Utilisé pour disperser les cellules de la pulpe dentaire
Trypsine de type II	Sigma-Aldrich	T-7409	Utilisé pour disperser neurones trigéminaux
Pince ultra fine	Outils de science fine	11370-40	Pince ultra fine pour la dissection
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750	Utilisé comme inhibiteur mitotique à 1 &mu ; Concentration M dans un milieu de co-culture, Jour 2
Système de filtration sous vide	Millipore	SCNY00060	Filtre jetable Steriflip, 50 &mu ; m filtre en filet nylon
Pince à flacons	Fine Science Tools	110006-15	Pince longue pour le transfert de tissus vers des cônes