Visualisering af østrogenreceptorer i koloner af mus med TNBS-induceret Crohns sygdom ved hjælp af immunofluorescens
Summary
Protokollen præsenterer en komplet valideret TNBS-induceret murine model af Crohns sygdom og metoder til visualisering af østrogen receptorer ved immunhistokemi ved hjælp af immunofluorescens af formalin-faste kolon sektioner indlejret i paraffin.
Abstract
Crohns sygdom er den mest diagnosticerede form for inflammatorisk tarmsygdom. Kronisk betændelse udvikler sig i tarmen fører til peristalkse lidelse og skader på tarmslimhinden og synes at være forbundet med en øget risiko for kolon neoplastisk transformation. Akkumulerende beviser tyder på, at østrogener og østrogen receptorer påvirker ikke kun hormon-følsomme væv, men også andre væv ikke direkte relateret til østrogener, såsom lunger eller tyktarmen. Her beskriver vi protokollen for vellykket immunfluorescens farvning af østrogenreceptorer i tyktarmen fremstillet af en murinemodel af TNBS-induceret Crohns sygdom. En detaljeret protokol for induktion af Crohns sygdom i mus og tarm præparat er fastsat samt en trin-for-trin immunhistokemiske procedure ved hjælp af formalin-faste paraffin-indlejrede tarm sektioner. De beskrevne metoder er ikke kun nyttige for østrogen receptor afsløring og østrogen signalering undersøgelse in vivo, men kan også anvendes til for andre proteiner, som kan være involveret i udviklingen af colitis.
Introduction
Crohns sygdom (CD) er en inflammatorisk tarmsygdom (IBD) manifesteret som kronisk tarm betændelse. Ætiologien af CD er dårligt forstået, men der er et par vigtige faktorer, der synes at være ansvarlig for CD udvikling, herunder intestinal mikrobiota, og genetiske og miljømæssige faktorer, såsom kost eller stress1. For en bedre forståelse af patogenesen af Crohns sygdom, flere modeller af tarmbetændelse er blevet brugt2,3,4,5,6,7. I denne artikel præsenterer vi resultater opnået fra en 2,4,6-trinitrobenzen sulfonsyre (TNBS)-induceret murine model af CD.
Det er blevet dokumenteret, at østrogener er i stand til at modulere kronisk tarmbetændelse8,9,10,11,12. Den biologiske aktivitet af østrogener er medieret af cognate receptorer, blandt hvilke er nukleare østrogen receptorer (ERs), dvs ERα (gen ESR1) og ERβ (genESR2), samt G protein-koblet østrogen receptor, dvs GPER (gen GPER1), benævnt membran-bundet ER13,14. Der er flere metoder til bestemmelse af niveauet af østrogen receptorer, men kun få kan bruges til at visualisere dem i tarmen.
Immunhistokemi (IHC) er en udbredt metode i kliniske og grundlæggende undersøgelser til påvisning af visse antigener i celler eller væv med fluoromoni-konjugerede antistoffer. IHC synes at være en vigtig metode i vævsstruktur visualisering, samt i identifikation og lokalisering af specifikke proteiner, som kan være afgørende for at forstå udviklingen af colitis. Her præsenterer vi en komplet og valideret protokol for immunhistokemisk visualisering af østrogenreceptorer i tarmen ved hjælp af immunfluorescens.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er mange dyremodeller til IBD-patologiundersøgelse, herunder genetiske, immunologiske eller spontane modeller samt kemisk inducerede modeller15. Blandt de mange typer af dyremodeller af colitis, kemisk inducerede modeller såsom TNBS-induceret model, der er beskrevet i denne protokol, er relativt billige og nemme at opnå. Den TNBS-inducerede murine model af colitis har flere kliniske symptomer relateret til den patologiske grundlag af CD. Dyr med induceret colitis er karakteriseret ved inkon…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet blev offentliggjort takket være den finansielle støtte fra University of Lodz myndigheder: Vicerektor for videnskabelig forskning, vicerektor for nationalt og internationalt samarbejde og dekanen for Fakultetet for Biologi og Miljøbeskyttelse. Damian Jacenik blev støttet af tilskud (2017/24/T/NZ5/00045 og 2015/17/N/NZ5/00336) fra National Science Centre, Polen.
Materials
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope – TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome – RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module – EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor – TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
References
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
- Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
- Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
- Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
- Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
- Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
- Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
- Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
- Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn’s disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
- Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
- Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
- Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn’s disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
- Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
- Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
