ضربة قاضية مستقرة من الجينات ترميز البروتينات مصفوفة خارج الخلية في خط الخلية Myoblast C2C12 باستخدام الصغيرة Hairpin (ش) RNA
Summary
نحن نقدم بروتوكول لضرب بشكل ثابت أسفل الجينات ترميز مصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات في C2C12 myoblasts باستخدام دبوس الشعر الصغيرة (ش) RNA. استهداف ADAMTSL2 كمثال، ونحن نصف أساليب للتحقق من كفاءة الضربة القاضية على مرنا، والبروتين، والمستوى الخلوي خلال C2C12 myoblast إلى التمايز myotube.
Abstract
مصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات حاسمة لتنمية العضلات والهيكل العظمي والتوازن. يمكن تطبيق الضربة القاضية المستقرة لترميز الجينات لبروتينات ECM في C2C12 myoblasts لدراسة دور هذه البروتينات في تنمية العضلات الهيكلية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لاستنفاد البروتين ECM ADAMTSL2 كمثال، وذلك باستخدام دبوس الشعر الصغيرة (ش) RNA في خلايا C2C12. بعد تحويل البلازميدات shRNA، تم اختيار الخلايا المستقرة دفعة باستخدام puromycin. كما وصفنا الحفاظ على هذه الخطوط الخلوية وتحليل الفينوتيبيك عبر تعبير مرنا، والتعبير البروتيني، والتمايز C2C12. مزايا هذه الطريقة هي توليد سريع نسبيا من خلايا C2C12 المنخفضة مستقرة والتمايز موثوق بها من خلايا C2C12 في myotubes متعددة النوية عند استنفاد المصل في وسط ثقافة الخلية. يمكن رصد التمايز من خلايا C2C12 عن طريق المجهر الميداني مشرق وقياس مستويات التعبير من الجينات علامة الكنسي، مثل MyoD، myogenin، أو سلسلة الميوسين الثقيلة (MyHC) مما يشير إلى تطور تمايز Myoblast C2C12 في الأنابيب الأوروبة. على النقيض من الضربة القاضية العابرة للجينات مع الحمض النووي الريبي الصغير التداخل (si) ، يمكن استهداف الجينات التي يتم التعبير عنها لاحقًا أثناء تمايز C2C12 أو أثناء نضوج اليوتيوب بشكل أكثر كفاءة عن طريق توليد خلايا C2C12 التي تعبر بشكل ثابت عن shRNA. القيود المفروضة على هذه الطريقة هي تباين في الكفاءة الضربة القاضية، اعتمادا على shRNA محددة التي يمكن التغلب عليها باستخدام استراتيجيات خروج المغلوب الجينات على أساس CRISPR/Cas9، فضلا عن الآثار المحتملة خارج الهدف من شرنا التي ينبغي النظر فيها.
Introduction
توفر بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) الدعم الهيكلي لجميع الأنسجة ، وتتوسط الاتصال بين الخلايا ، وتحدد مصير الخلية. تشكيل وإعادة عرض ديناميكية من ECM وبالتالي أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الأنسجة والجهاز التوازن1،2. المتغيرات المرضية في العديد من الجينات الترميز لبروتينات ECM تؤدي إلى اضطرابات العضلات والعظام مع الأنماط الظاهرية التي تتراوح بين ضمور العضلات لبناء pseudomouscular3،4. على سبيل المثال ، المتغيرات المسببة للأمراض في ADAMTSL2 تسبب اضطراب العضلات والعظام نادرة للغاية geleophysic خلل التنسج ، الذي يقدم مع بناء العضلات الزائفة ، أي زيادة واضحة في كتلة العضلات الهيكل العظمي5. جنبا إلى جنب مع بيانات التعبير الجيني في الماوس والبشر، وهذا يشير إلى دور لADAMTSL2 في تنمية العضلات الهيكل العظمي أو التوازن6،7.
تم تطوير البروتوكول الذي نصفه هنا لدراسة الآلية التي يقوم بها ADAMTSL2 بتعدل تنمية العضلات الهيكلية و / أو التوازن في إعداد زراعة الخلايا. نحن ضرب نابلة إلى أسفل ADAMTSL2 في خط الخلية myoblast Murine C2C12. C2C12 myoblasts وتمايزها في الأنابيب العضلية هو نموذج ثقافة الخلية الموصوفة بشكل جيد والمستخدمة على نطاق واسع للتمايز العضلات والهيكل العظمي الهندسة الحيوية العضلات8،9. تمر خلايا C2C12 بخطوات تمايز متميزة بعد انسحاب المصل، مما يؤدي إلى تكوين أنابيب الأوولب متعددة النواة بعد 3-10 أيام في الثقافة. يمكن مراقبة خطوات التمايز هذه بشكل موثوق من خلال قياس مستويات مرنا من جينات العلامات المتميزة ، مثل MyoD أو myogenin أو سلسلة myosin الثقيلة (MyHC). إحدى مزايا توليد ضربات قاضية جينية مستقرة في خلايا C2C12 هي أن الجينات التي يتم التعبير عنها في مراحل لاحقة من تمايز C2C12 يمكن استهدافها بشكل أكثر كفاءة، مقارنة بالضربة القاضية العابرة التي حققها الحمض النووي الريبي الصغير التداخل (si) ، والذي يستمر عادة لمدة 5-7 أيام بعد الترانزفيشن ، ويتأثر بكفاءة الترانزفي. والميزة الثانية للبروتوكول كما هو موضح هنا هو الجيل السريع نسبيا من دفعات من الخلايا الضربة القاضية C2C12 باستخدام اختيار puromycin. البدائل، مثل CRISPR/Cas9 بوساطة الجينات بالضربة القاضية أو عزل سلائف الخلايا العضلية الهيكلية الأولية من الفئران البشرية أو الجينات المستهدفة ناقصة هي من الناحية الفنية أكثر صعوبة أو تتطلب توافر خزعات العضلات المريض أو الفئران المنقوصة الجينات المستهدفة، على التوالي. ومع ذلك ، على غرار النهج الأخرى القائمة على ثقافة الخلايا ، هناك قيود في استخدام خلايا C2C12 كنموذج للتمايز خلايا العضلات الهيكلية ، مثل الطبيعة ثنائية الأبعاد (2D) للإعداد ثقافة الخلية وعدم وجود بيئة مجهرية في الجسم الحي التي تعتبر حاسمة للحفاظ على خلايا السلائف العضلية الهيكلية غير المتمايزة10.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن نصف هنا بروتوكول لضربة قاضية مستقرة من بروتينات ECM في C2C12 myoblasts وتحليل فينوتيبيك للتمايز من C2C12 myoblasts في الأنابيب الأومية. وهناك عدة عوامل تحدد نتيجة التجربة وتحتاج إلى النظر فيها بعناية. الحفاظ على خلايا C2C12 في مرحلة التكاثر هو خطوة حاسمة للحفاظ على خلايا C2C12 في حالة السلائف myoblast. الحفاظ …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.H. بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (المعهد الوطني لالتهاب المفاصل والأمراض العضلية الهيكلية والجلدية، NIAMS، رقم المنحة AR070748) والتمويل الأولي من قسم ليني وبيتر دبليو مايو لجراحة العظام، كلية إيكان للطب في جبل سيناء.
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | 191784 | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423 | |
| Ampicillin | Fisher Bioreagents | BP1760-5 | |
| Automated cell counter Countesse II | Invitrogen | A27977 | |
| Bradford Reagent | Thermo Scientific | P4205987 | |
| C2C12 cells | ATCC | CRL-1772 | |
| Chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | 183172 | |
| DMEM | GIBCO | 11965-092 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| DNase I (Amplification Grade) | Invitrogen | 18068015 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 97068-085 | |
| GAPDH | EMD Millipore | MAB374 | |
| Glycine | VWR Life Sciences | 19C2656013 | |
| Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) | Li-Cor | C90130-02 | |
| Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) | Jackson Immune Research | 133389 | |
| HCl | Fisher Chemical | A144S | |
| Incubator (Shaker) | Denville Scientific Corporation | 1704N205BC105 | |
| Mercaptoethanol | Amresco, VWR Life Sciences | 2707C122 | |
| Midiprep plasmid extraction kit | Qiagen | 12643 | |
| Myosin 4 (myosin heavy chain) | Invitrogen | 14-6503-82 | |
| Mounting medium | Invitrogen | 2086310 | |
| NaCl | VWR Life Sciences | 241 | |
| non-ionic surfactant/detergent | VWR Life Sciences | 18D1856500 | |
| Paraformaldehyde | MP | 199983 | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP399-4 | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | GIBCO | 15140-122 | |
| Petridishes | Corning | 353003 | |
| Polypropylene tubes | Fisherbrand | 149569C | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 33576300 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| PCR (Real Time) | Applied Biosystems | 4359284 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Applied Biosystems | 4368814 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | TK274910 | |
| sh control plasmid | Sigma-Aldrich | 07201820MN | |
| sh 3086 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092578 | |
| sh 972 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092579 | |
| sh 1977 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092582 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Scientific | NanoDrop One C | |
| SYBR Green Reagent Master Mix | Applied Biosystems | 743566 | |
| Trichloroacetic acid | Acros Organics | 30145369 | |
| Trizol reagent | Ambion | 254707 | |
| Trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421 | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco-Life Technology Corporation | 2085459 | |
| Water (DEPC treated and nuclease free) | Fisher Bioreagents | 186163 | |
| Western blotting apparatus | Biorad | Mini Protean Tetra Cell | |
| Yeast extract | Fisher Bioreagents | BP1422 |
References
- Tanzer, M. L. Current concepts of extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (3), 326-331 (2006).
- Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extracellular matrix: novel insights. Current Opinion in Rheumatology. 25 (1), 65-70 (2013).
- Sakai, L. Y., Keene, D. R. Fibrillin protein pleiotropy: Acromelic dysplasias. Matrix Biology. 80, 6-13 (2019).
- Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases. Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).
- Le Goff, C., et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation. Nature Genetics. 40 (9), 1119-1123 (2008).
- Dubail, J., Apte, S. S. Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics. Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).
- Koo, B. H., et al. ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis. Matrix Biology. 26 (6), 431-441 (2007).
- Khodabukus, A., Baar, K. The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (12), 2198-2207 (2014).
- Bajaj, P., et al. Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts. Integrative Biology. 3 (9), 897-909 (2011).
- Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease. Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).
- Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice. Bio-protocol. 7 (9), 2248 (2017).
- Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (2), 029298 (2017).
- Lawson, M. A., Purslow, P. P. Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific. Cells Tissues Organs. 167 (2-3), 130-137 (2000).
- Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability. Biotechnology and Bioengineering. 107 (5), 894-901 (2010).
- Cheng, C. S., et al. Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), 385-395 (2014).
- Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
- Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER. Gene Therapy. 5 (4), 542-551 (1998).
- Balcı, B., Dinçer, P. Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix. Biotechnology Journal. 4 (7), 1042-1045 (2009).
- Xia, D., et al. Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591 (1), 163-173 (2002).
- Tapia, O., Gerace, L. Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation. Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).
- Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents. Molecular Biotechnology. 46 (3), 287-300 (2010).
- Luo, J., et al. An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway. International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).
- Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer. Experimental Cell Research. 286 (1), 87-95 (2003).
- Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 934-939 (2003).
- Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. Biolistic transfection of cultured myotubes. Science’s STKE. 2003 (192), 11 (2003).
- Shintaku, J., et al. MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
