Stabil nedsättning av gener kodning extracellulära Matrix Proteiner i C2C12 Myoblast Cell Line med små hårnål (sh)RNA
Summary
Vi tillhandahåller ett protokoll för att stabilt slå ner gener som kodar extracellulära matrisproteiner (ECM) i C2C12-myoblaster med små hårnål (sh) RNA. Med inriktning på ADAMTSL2 som exempel beskriver vi metoderna för validering av knockdown-effektiviteten på mRNA-, protein- och cellnivå under C2C12-myoblast till myotubedifferentiering.
Abstract
Extracellulära matrisproteiner (ECM) är avgörande för skelettmuskulaturens utveckling och homeostas. Den stabila knockdown av gener kodning för ECM proteiner i C2C12 myoblaster kan tillämpas för att studera den roll som dessa proteiner i skelettmuskulaturutveckling. Här beskriver vi ett protokoll för att tömma ECM proteinET ADAMTSL2 som ett exempel, med hjälp av små hårnål (sh) RNA i C2C12 celler. Efter transfection av shRNA plasmids, stabila celler var batch-utvalda med puromycin. Vi beskriver vidare underhållet av dessa cellinjer och den fenotypiska analysen via mRNA-uttryck, proteinuttryck och c2C12-differentiering. Fördelarna med metoden är den relativt snabba generationen av stabila C2C12 knockdown celler och tillförlitlig differentiering av C2C12 celler i flerkärniga myotubes vid utarmning av serum i cellodlingsmediet. Differentiering av C2C12 celler kan övervakas av ljusa fält mikroskopi och genom att mäta uttrycksnivåerna av kanoniska markör gener, såsom MyoD, myogenin, eller myosin tung kedja (MyHC) som anger utvecklingen av C2C12 myoblast differentiering i myotubes. I motsats till den övergående nedsättningen av gener med små störande (si) RNA kan gener som uttrycks senare under C2C12-differentiering eller under myotube-mognad riktas mer effektivt genom att generera C2C12-celler som hugger shRNA. Begränsningar av metoden är en variation i knockdown effektivitet, beroende på de specifika shRNA som kan övervinnas genom att använda gen knockout strategier baserade på CRISPR /Cas9, samt potentiella off-target effekter av shRNA som bör beaktas.
Introduction
ECM-proteiner (Extracellular Matrix) ger strukturellt stöd för alla vävnader, medla cellcellkommunikation och bestämmer cellödet. Bildandet och dynamisk ombyggnad av ECM är därför avgörande för att upprätthålla vävnad och organ homeostas1,2. Patologiska varianter i flera gener kodning för ECM proteiner ger upphov till muskuloskeletala sjukdomar med fenotyper från muskeldystrofier till pseudomouscular bygga3,4. Till exempel, patogena varianter i ADAMTSL2 orsaka extremt sällsynta muskuloskeletala sjukdom geleophysic dysplasi, som presenterar med pseudomuskulära bygga, dvs en uppenbar ökning av skelettmuskulatur massa5. Tillsammans med genuttrycksdata hos mus och människor tyder detta på en roll för ADAMTSL2 i skelettmuskelutveckling eller homeostas6,7.
Protokollet som vi beskriver här har utvecklats för att studera den mekanism genom vilken ADAMTSL2 modulerar skelettmuskelutveckling och/eller homeostas i en cellkulturinställning. Vi slog knivhuggna ADAMTSL2 i murine C2C12 myoblast cellinjen. C2C12 myoblaster och deras differentiering i myotubes är en väl beskriven och allmänt använd cellodling modell för skelettmuskulatur differentiering och skelettmuskulatur bioteknik8,9. C2C12 celler går igenom distinkta differentiering steg efter serum tillbakadragande, vilket resulterar i bildandet av multinucleated myotubes efter 3−10 dagar i kultur. Dessa differentieringssteg kan övervakas tillförlitligt genom att mäta mRNA-nivåer av distinkta markörgener, såsom MyoD, myogenin eller myosin tung kedja (MyHC). En fördel med att generera stabila genknockdowns i C2C12 celler är att gener som uttrycks i senare stadier av C2C12 differentiering kan riktas mer effektivt, jämfört med övergående knockdown uppnås genom små-störande (si) RNA, som vanligtvis varar i 5−7 dagar efter transfection, och påverkas av transfection effektivitet. En andra fördel med protokollet som beskrivs här är den relativt snabba generationen av partier av C2C12 knockdown celler med puromycin urval. Alternativ, såsom CRISPR/Cas9-medierad genknockout eller isolering av primära skelettmuskulaturens prekursorer från mänskliga eller målbetingade möss är tekniskt mer utmanande eller kräver tillgång till patientmuskelbiopsier eller mål-gen bristfälliga möss, respektive. Men liknar andra cellkultur baserade metoder, det finns begränsningar i användningen av C2C12 celler som modell för skelettmuskulaturen cell differentiering, såsom tvådimensionella (2D) karaktär cellkultur set-up och bristen på in vivo mikromiljö som är avgörande för att upprätthålla odifferentierade skelettmuskulaturen föregångare celler10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver här ett protokoll för en stabil nedsättning av ECM proteiner i C2C12 myoblasts och för fenotypiskanalys av differentiering av C2C12 myoblaster i myotubes. Flera faktorer avgör resultatet av experimentet och måste övervägas noggrant. Att underhålla C2C12-celler i den växande fasen är ett viktigt steg för att hålla C2C12-cellerna i myoblastprekursortillståndet. Att behålla C2C12-cellernas förmåga att konsekvent skilja åt i myorör beror på i) cellernas passagenummer, ii) tätheten av de odla…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.H. stöds av National Institutes of Health (National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, NIAMS, bidragsnummer AR070748) och utsädesfinansiering från Leni & Peter W. Maj Institutionen för ortopedi, Icahn School of Medicine på Mt. Sinai.
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | 191784 | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423 | |
| Ampicillin | Fisher Bioreagents | BP1760-5 | |
| Automated cell counter Countesse II | Invitrogen | A27977 | |
| Bradford Reagent | Thermo Scientific | P4205987 | |
| C2C12 cells | ATCC | CRL-1772 | |
| Chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | 183172 | |
| DMEM | GIBCO | 11965-092 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| DNase I (Amplification Grade) | Invitrogen | 18068015 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 97068-085 | |
| GAPDH | EMD Millipore | MAB374 | |
| Glycine | VWR Life Sciences | 19C2656013 | |
| Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) | Li-Cor | C90130-02 | |
| Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) | Jackson Immune Research | 133389 | |
| HCl | Fisher Chemical | A144S | |
| Incubator (Shaker) | Denville Scientific Corporation | 1704N205BC105 | |
| Mercaptoethanol | Amresco, VWR Life Sciences | 2707C122 | |
| Midiprep plasmid extraction kit | Qiagen | 12643 | |
| Myosin 4 (myosin heavy chain) | Invitrogen | 14-6503-82 | |
| Mounting medium | Invitrogen | 2086310 | |
| NaCl | VWR Life Sciences | 241 | |
| non-ionic surfactant/detergent | VWR Life Sciences | 18D1856500 | |
| Paraformaldehyde | MP | 199983 | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP399-4 | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | GIBCO | 15140-122 | |
| Petridishes | Corning | 353003 | |
| Polypropylene tubes | Fisherbrand | 149569C | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 33576300 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| PCR (Real Time) | Applied Biosystems | 4359284 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Applied Biosystems | 4368814 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | TK274910 | |
| sh control plasmid | Sigma-Aldrich | 07201820MN | |
| sh 3086 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092578 | |
| sh 972 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092579 | |
| sh 1977 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092582 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Scientific | NanoDrop One C | |
| SYBR Green Reagent Master Mix | Applied Biosystems | 743566 | |
| Trichloroacetic acid | Acros Organics | 30145369 | |
| Trizol reagent | Ambion | 254707 | |
| Trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421 | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco-Life Technology Corporation | 2085459 | |
| Water (DEPC treated and nuclease free) | Fisher Bioreagents | 186163 | |
| Western blotting apparatus | Biorad | Mini Protean Tetra Cell | |
| Yeast extract | Fisher Bioreagents | BP1422 |
References
- Tanzer, M. L. Current concepts of extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (3), 326-331 (2006).
- Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extracellular matrix: novel insights. Current Opinion in Rheumatology. 25 (1), 65-70 (2013).
- Sakai, L. Y., Keene, D. R. Fibrillin protein pleiotropy: Acromelic dysplasias. Matrix Biology. 80, 6-13 (2019).
- Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases. Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).
- Le Goff, C., et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation. Nature Genetics. 40 (9), 1119-1123 (2008).
- Dubail, J., Apte, S. S. Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics. Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).
- Koo, B. H., et al. ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis. Matrix Biology. 26 (6), 431-441 (2007).
- Khodabukus, A., Baar, K. The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (12), 2198-2207 (2014).
- Bajaj, P., et al. Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts. Integrative Biology. 3 (9), 897-909 (2011).
- Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease. Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).
- Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice. Bio-protocol. 7 (9), 2248 (2017).
- Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (2), 029298 (2017).
- Lawson, M. A., Purslow, P. P. Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific. Cells Tissues Organs. 167 (2-3), 130-137 (2000).
- Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability. Biotechnology and Bioengineering. 107 (5), 894-901 (2010).
- Cheng, C. S., et al. Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), 385-395 (2014).
- Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
- Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER. Gene Therapy. 5 (4), 542-551 (1998).
- Balcı, B., Dinçer, P. Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix. Biotechnology Journal. 4 (7), 1042-1045 (2009).
- Xia, D., et al. Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591 (1), 163-173 (2002).
- Tapia, O., Gerace, L. Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation. Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).
- Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents. Molecular Biotechnology. 46 (3), 287-300 (2010).
- Luo, J., et al. An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway. International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).
- Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer. Experimental Cell Research. 286 (1), 87-95 (2003).
- Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 934-939 (2003).
- Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. Biolistic transfection of cultured myotubes. Science’s STKE. 2003 (192), 11 (2003).
- Shintaku, J., et al. MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
