זיהוי של המלכודות נויטרופילים מסחטות ב פרפין-מוטבע בעורקים בעורק החתולים באמצעות מיקרוסקופ אימונולומוטורנציה
Summary
אנו מתארים את השיטה כדי לזהות השמנות נויטרופילים מסחטות (רשתות) ב פורמלדהיד-קבוע ו פרפין-מוטבע העורקים בעורק העורקי באמצעות החום המושרה אנטיגן ופרוטוקול immunolabeling כפול.
Abstract
מלכודות מסחטות נויטרופילים (רשתות), מורכב של DNA ללא תא (cfdna) וחלבונים כמו יסטוניים ו נויטרופילים elastase (NE), משתחררים על ידי נויטרופילים בתגובה לדלקת מערכתית או פתוגנים. למרות רשתות הוכחו בעבר להגדיל את היווצרות קריש ולעכב fibrinolysis בבני אדם וכלבים, את התפקיד של רשתות אצל חתולים עם ידע העורקים הקרדיוגנטית (קייט), סיבוך מסכנת חיים משני כדי יפרטרופית מחלת שריר הלב , אינו ידוע. שיטה סטנדרטית לזיהוי ולכמת רשתות בתרובי העורקים הקרדיוגנטית אצל חתולים, תקדם את הבנתנו את תפקידם הפתולוגי בקייט. כאן, אנו מתארים טכניקה כדי לזהות רשתות ב פורמלדהיד-קבוע ו פרפין-מוטבע הטרובי בתוך הבייון אבי העורקים, שחולצו במהלך נקרופסי. בעקבות הסיכום עם קסילן, מקטעים של אבי העורקים עברו לאיחזור אנטיגן עקיף המושרה בחום. מקטעים נחסמו אז, החדיר, ו לשעבר vivo נטס זוהו על ידי לוקליזציה של ה-dna ללא תא (cfdna), מcitH3 היסטון מH3 ה, ו נויטרופילים elastase (NE) באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence. כדי לייעל את גילוי החיסוני של רשתות בתרובי, הקרינה האוטומטית של רכיבי הרקמה הוגבלה באמצעות תהליך מקושה לפני מיקרוסקופ. טכניקה זו עשויה להיות כלי שימושי לחקר רשתות ופקקת במינים אחרים ומציעה תובנות חדשות לתוך הפתופסולוגיה של מצב מורכב זה.
Introduction
חתולים עם יפרטרופית שריר הלב הם בסיכון של מסכנת חיים thromboembolic סיבוכים1,2. למרות התחלואה והתמותה הגבוהים הקשורים לידע העורקים (קייט), הפתופסולוגיה הבסיסית של קייט אצל חתולים מובנת בצורה גרועה. יש גם כלים מוגבלים אבחון וטיפולי לטפל ולזהות חתולים בסיכון זה מצב הרסני3.
בנוסף לתפקידה בחסינות מולדת, נויטרופילים הוכחו לשחק תפקיד פקקת על ידי שחרור מלכודות נויטרופילים מסחטות (רשתות), שהם רשתות כמו רשת של DNA ללא תא (cfDNA) מצופה עם האבנים וחלבונים בעלי כגון נויטרופילים elastase (NE) ו myeloperoxidase. נויטרופילים לעבור רשתות היווצרות בתגובה לדלקת מערכתית, מפגש ישיר עם פתוגנים, אינטראקציה עם טסיות מופעל4,5,6,7. אצל כלבים, נויטרופילים הנגזר DNA הוכח לעכב את הליזה קריש, בעוד חלבונים נטו להאיץ את היווצרות קריש. היכולת של רשתות להשמנה תאים מחזורי ורכיבי קרישת דם הוא גם מפתח למאפייני thrombogenic שלהם8,9,10,11,12.
הרשתות מזוהות על ידי לוקליזציה של חלבונים נויטרופילים, האבנים, ו cfDNA. בשל כך, הזיהוי והקוונפיקציה של רשתות ברקמות קבועות על-ידי immunofluorescence מרקמות של ממחטות הנייר מעולה למטאוקסילין המסורתי ולאאוזין (H & E) באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר4,5. מספר מחקרים אנושיים באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence מזוהה רשתות כרכיבים מבניים של תרובי עורקים בעורק כלילי, שבץ מוחי התרובי, atherothrombosis, ו בורידים ורידים13,14,15,16,17. עד כה, לא תוארה שיטה סטנדרטית לזיהוי ולכמת רשתות בקריבי חתולים. מכיוון שזיהוי רשתות בתרופני העורקים הכאותית של חתולים עשוי להקל על מחקר הטרנסשלאני העתידי ברשתות ובפקקת, אנו מתארים טכניקות של זיהוי נטו והערכה ב-פרפין-התרובי העורקים המוטבעים אצל חתולים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי רשתות בתרובי העורקים הדו-קרדיוגנטיים הקבועים באמצעות פרוטוקול חיסוני כפול ומיקרוסקופ אימונולובורנציה. למרות שרק תרובי עורקי העורקים היו מוכתמים, בתאוריה זו ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עבור סוגים אחרים של התרובי ומינים וטרינריים אחרים. זיהוי רשתות בתוך תרופני חת…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר נתמך על ידי קרנות מאוניברסיטת קליפורניה, דיוויס, המרכז לבריאות בעלי חיים לוויה (CCAH 2018-30-F). המחברים רוצים להכיר בדוקטור קווין וולארד לשימוש במיקרוסקופ הזריחה.
Materials
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
References
- Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).
- Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
- Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
- Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
- Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
- Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).
- Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
- Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
- Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).
- Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
- Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
- Rait, V. K., Xu, L., O’Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
- Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
- Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
- Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
- Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
