Creazione in Situ Circuito Chiuso Perfusione di Organi Addominali Inferiori e Arti Hind in Topi
Summary
Un protocollo è descritto per la perfusione in situ del corpo inferiore del topo, tra cui la vescica, la prostata, gli organi sessuali, l’osso, il muscolo e la pelle del piede.
Abstract
La perfusione ex vivo è un importante strumento fisiologico per studiare la funzione degli organi isolati (ad es. fegato, reni). Allo stesso tempo, a causa delle piccole dimensioni degli organi di topo, la perfusione ex vivo di ossa, vescica, pelle, prostata e organi riproduttivi è impegnativa o non fattibile. Qui, riportiamo per la prima volta un circuito di perfusione in situ inferiore del corpo nei topi che include i tessuti di cui sopra, ma bypassa i principali organi di clearance (rene, fegato e milza). Il circuito è stabilito cannulando l’aorta addominale e vena cava inferiore sopra l’arteria iliac e la vena e cauterizzare i vasi sanguigni periferici. La perfusione viene eseguita tramite una pompa peritale con flusso di perfnone mantenuto fino a 2 h. La colorazione in situ con lectina fluorescente e la soluzione Hoechst hanno confermato che la microvaslatura è stata perfusa con successo. Questo modello murino può essere uno strumento molto utile per studiare i processi patologici, nonché i meccanismi di somministrazione di farmaci, la migrazione/metastasi delle cellule tumorali circolanti in/dal tumore e le interazioni del sistema immunitario con organi e tessuti perfusi.
Introduction
La perfusione di organi isolati è stata originariamente sviluppata per studiare la fisiologia degli organi per il trapianto1,2,3e ha permesso di comprendere le funzioni degli organi senza interferenze da altri sistemi corporei. Ad esempio, la perfusione isolata di reni e cardiaci è stata immensamente utile per comprendere i principi di base dell’emodinamica e degli effetti degli agenti vasoattivi, mentre la perfusione epatica era importante per comprendere la funzione metabolica, compreso il metabolismo dei farmaci nel tessuto sano e malato4,5,6,7. Inoltre, gli studi di perfusione sono stati fondamentali per comprendere la vitalità e la funzione degli organi destinati al trapianto. In Cancer Researchearch, la perfusione tumorale isolata è stata descritta da diversi gruppi utilizzando topo, ratto e tessuti umani appena resezionati8,9. In qualche perfusione tumorale isolato, il tumore è stato impiantato nel tampone di grasso ovarico per forzare la crescita del tumore che fornisce vasi sanguigni dall’arteria mesenteria10. Il gruppo giainista ha eseguito studi pionieristici utilizzando perfusione isolata di adenocarcinomi del colon per comprendere l’emodinamica tumorale8,11,12,13. Altre innovative configurazioni ex vivo ingegnerizzate includono un dispositivo di perfusione a base di piastra 96 per colture le cellule primarie del mieloma multiplo umano14 e una camera di flusso modulare per l’architettura del midollo osseo e la ricerca sulle funzioni15.
Oltre agli studi di fisiologia e patologia, la perfusione di organi è stata utilizzata per studiare i principi di base della somministrazione di farmaci. Così, un gruppo ha descritto la perfusione isolata degli arti di ratto e ha studiato l’accumulo di liposomi nei sarcomi impiantati16, mentre un altro gruppo ha eseguito la perfusione renale umana per studiare il targeting endoteliale delle nanoparticelle17. Ternullo et al. utilizzato un lembo della pelle umana perfuso isolato come un modello di penetrazione dei farmaci per la pelle vicino a in vivo18.
Nonostante questi progressi nella perfusione di grandi organi e tessuti, non ci sono state segnalazioni su modelli di perfusione in situ nei topi che: a) bypassare organi di gioco come fegato, milza e reni; b) includere organi pelvici, pelle, muscoli, organi riproduttivi (nel maschio), vescica, prostata e midollo osseo. A causa delle piccole dimensioni di questi organi e della vascolatura di fornitura, la cannulazione ex vivo e la creazione di un circuito di perfusione non è stato fattibile. Il topo è il modello animale più importante nella ricerca sul cancro e sull’immunologia e nella somministrazione di farmaci. La capacità di perfusire piccoli organi di topi consentirebbe di rispondere a interessanti domande riguardanti la somministrazione di farmaci a questi organi, compresi i tumori impiantati nel bacino (vescica, prostata, ovaia, midollo osseo), nonché studi sulla fisiologia di base e l’immunologia delle malattie di questi organi. Per affrontare questa carenza, abbiamo sviluppato un circuito di perfusione in situ nei topi che può potenzialmente evitare lesioni tissutali ed è molto più adatto per la ricerca funzionale rispetto alla perfusione di organi isolati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il circuito descritto può essere utilizzato per sondare varie domande di ricerca, ad esempio il ruolo di diversi componenti del siero e barriere tissutali nella somministrazione di farmaci o nel traffico di cellule immunitarie e staminali. Diversi sistemi di somministrazione di farmaci (ad esempio, liposomi e nanoparticelle) possono essere aggiunti al perfusate per comprendere il ruolo dei fattori fisiologici e biochimici nella consegna. La durata della perfusione può variare, a seconda del tessuto studiato, degli obie…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è stato sostenuto dalla concessione NIH CA194058 a DS, Skaggs School of Pharmacy ADR seed grant program (DS); National Natural Science Foundation of China (Grant n. 31771093), il Progetto di Collaborazione Internazionale della Provincia di Jilin (No.201180414085GH), i Fondi di Ricerca Fondamentali per le Università Centrali, il Programma per JLU Science and Technology Innovative Research Team (2017TD-27, 2019TD-36).
Materials
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
References
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