Markerless Gene Deletion par Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Summary

Décrit ici est une méthode pour la suppression ciblée et sans marqueur de gène dans Chlamydia trachomatis utilisant la mutagénèse allélique d'échange allélique de cassette floxed, FLAEM.

Abstract

Chlamydia trachomatis est un agent pathogène intracellulaire obligatoire qui a été historiquement difficile à manipuler génétiquement. Les progrès définitifs dans l'élucidation des mécanismes que C. trachomatis emploient pour créer et maintenir une niche intracellulaire privilégiée ont été limités en raison d'un manque d'outils génétiques. Heureusement, il y a eu récemment plusieurs nouvelles avancées dans les techniques de manipulation génétique. Parmi ceux-ci est le développement de la mutagénèse allélique d'échange de fluorescence-rapportée (FRAEM). Cette méthode permet la suppression ciblée des gènes couplée à l'insertion d'une cassette de sélection codant la résistance aux antibiotiques et la protéine fluorescente verte (GFP). La dépendance à l'égard de cette stratégie peut être compliquée lorsque l'on cible les gènes dans les opérons polycistroniques en raison du potentiel d'effets polaires sur les gènes en aval. La mutagénèse d'échange allélique de cassette floxed (FLAEM), dont le protocole est décrit ici, a été développée pour alléger des effets polaires cassette-induits. FLAEM utilise l'édition du génome Cre-loxP pour supprimer la cassette de sélection après suppression ciblée par échange allélique. Les souches résultantes contiennent des suppressions de gènes sans marqueur d'une ou de plusieurs séquences de codage. Cette technique facilite l'évaluation directe de la fonction génique et élargit le répertoire d'outils de manipulation génétique chez C. trachomatis.

Introduction

La chlamydia trachomatis est la principale cause de maladies bactériennes sexuellement transmissibles et représente un fardeau important pour la santé humaine. Plus de 100 millions de personnes sont infectées chaque année par C. trachomatis¹. Environ 70% des infections chez les femmes sont asymptomatiques en dépit des effets néfastes sur la santé reproductive, tels que la maladie inflammatoire pelvienne, la grossesse extra-utérine, et / ou l'infertilité. La séquelle de la maladie est directement liée à l'immunopathologie initiée par l'infection à C. trachomatis ². Un vaccin efficace n'a pas enc....

Protocol

1. Conception et assemblage de pSUmC-4.0 avec des armes homologiques spécifiques au gène d'intérêt

1. Identifier les régions de 3 kb directement en amont et en aval du gène ciblé pour la suppression pour servir de bras d'homologie de 5' et 3' pour la recombinaison homologue (figure 1).
2. Conception PCR amorces à 1) amplifier le bras d'homologie de 3 kb 5 ' de l'ADN génomique chlamydial et 2) contiennent un surplomb de 15 à 30 bp spécifique à pSUmC-4.0 lorsqu'il est digéré au site d'enzymes de restriction Sall. Assurez-vous que les régions d'amorce qui se chevauchent avec le pSUmC-4.0 ont des températures de fonte de 55 oC e....

Results

La méthode pour la suppression de gène sans marqueur dans C. trachomatis utilisant FLAEM dépend des techniques soigneuse de clonage et de transformation. La recombinaison allélique réussie est une première étape essentielle et nécessite l'identification et l'insertion de bras homologiques dans le vecteur de clonage pSUmC-4.0 (Figure 1). Une deuxième étape essentielle pour la suppression de gène sans marqueur est l'enlèvement du journaliste de fluorescence et de la cassette de sélect.......

Discussion

Le protocole décrit ici pour la génération des suppressions de gènes sans marqueurdans C. trachomatis par FLAEM permet la suppression ciblée des gènes non essentiels et élimine les effets polaires induits par cassette. Le protocole repose sur la conception soignée de 5' et 3' bras d'homologie insérés dans le vecteur de suicide pSUmC 4.0, la transformation efficace de C. trachomatis, et le dépistage minutieux des souches mutantes isolées. L'ingénierie génomique réussie par cette méthode a comme conséquen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	KSE Scientific	BMK-A1705	Biologie moléculaire
Chlorhydrate d’anhydrotétracycline	ACROS Organics	233131000
CaCl2 Tampon			10 mM Tris pH 7,4, 50 mM Chlorure de calcium dihydraté
Chlorure de calcium dihydraté Sigma		C7902-500G	Convient pour la culture cellulaire
Cycloheximide	Sigma	7698-1G
dam-/dcm- Compétent E. coli	New England BioLabs	C2925H
DMSO	ATCC	4-X	Culture cellulaire filtrée stérile testée
Acide glutamique	Sigma	G8415-100G	Acide L-glutamique
Milieu de croissance #1			Milieu RPMI 1640 complété par 10 % (vol/vol) de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur.
Milieu de croissance #2			RPMI 1640 complété par 10 % (vol/vol) de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS) et 1 µ ; g/mL de cycloheximide
saline équilibrée de Hanks (HBSS) (1x)	Gibco	24020-117
Sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur qualifié One Shot (FBS)	Gibco	A38402-02
McCoy Cells	ATCC	CRL-1696
Monarch Plasmid Miniprep Kit	New England BioLabs	T1010S	Purification
de l’ADN à petite échelleNaH2PO4	Sigma	S3139-250G	Phosphate de sodium monobasique
Na2HPO4	Sigma	S5136-500G	Phosphate de sodium dibasique
NEB 10-bêta Cellules électrocompétentes E. coli Cellules	New England BioLabs	C3020K
NEBuilder Assemblage d’ADN HiFi Kit de clonage	Nouveau Angleterre BioLabs	E5520S	Gibson Kit d’assemblage
Pénicilline G sel de sodium	Sigma	P3032-10MU	Bioréactif adapté à la culture cellulaire
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12162	Purification de l’ADN à grande échelle
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase	New England BioLabs	M0515	Fragment PCR Polymérase
RPMI 1640 Medium (1x)	Gibco	11875-093	Contenant 2 mM de L-glutamine
Sall-HF	New England BioLabs	R3138S
Sbfl-HF	New England BioLabs	R3642S
Milieu de sélection #1			RMPI 10 % FBS, 1 & micro ; g/mL de cycloheximide, 500 et micro ; g/mL de spectinomycine et 50 ng/mL de tétracycline anhydre dissoute dans
DMSO Milieu de sélection #2			RMPI 10 % FBS, 1 & micro ; g/mL de cycloheximide, 500 et micro ; g/mL de spectinomycine
Milieu de sélection #3			RPMI 10 % FBS, 1 & micro ; g/mL de cycloheximide, 50 ng/mL d’aTc et 0,6 & micro ; g/mL de pénicilline
Acétate de sodium Buffer Solution	Sigma	S7899-100ML	3M
SOC Outgrowth Medium	New England BioLabs	B9020SVIAL
Spectinomycine dichlorhydrate pentahydraté, Qualité de culture cellulaire	Alfa Aesar	J61820
Saccharose	Sigma	S1888-1KG	Bioréactif adapté à la culture cellulaire
Tampon saccharose-phosphate-glutamate (SPG)			37,5 g de saccharose, 1,25 g de Na2HPO4, 0,18 g de NaH2PO4, 0,36 d’acide glutamique pour 500 ml d’eau de qualité culture tissulaire
Tris	AMRESCO	0497-5KG
Trypsine-EDTA de qualité ultrapure (1x)	Gibco	25200-056	0,25 %
Eau	Sigma	W3500-500ML	Filtre stérile, Bioréactif, Convient à la culture cellulaire