العلامة حذف الجينات من قبل Floxed كاسيت أليليتش تبادل Mutagenesis في الكلاميديا trachomatis
Summary
وصف هنا هو وسيلة لاستهداف, حذف الجينات markerless في الكلاميديا trachomatis باستخدام الكاسيت floxed الطفرات تبادل أليليس, FLAEM.
Abstract
الكلاميديا التراخورات هو مسببات الأمراض الملزمة داخل الخلايا التي كان من الصعب تاريخيا للتلاعب وراثيا. وقد تم الحد من التقدم النهائي في توضيح الآليات التي تستخدم C. trachomatis لإنشاء والحفاظ على مكانة متميزة داخل الخلايا بسبب نقص الأدوات الوراثية. لحسن الحظ، كانت هناك مؤخرا العديد من التطورات الجديدة في تقنيات التلاعب الجيني. ومن بين هذه هو تطوير الفلورسينسي ذكرت الطفرات تبادل أليليتش (FRAEM). تسمح هذه الطريقة بحذف الجينات المستهدفة إلى جانب إدخال شريط اختيار ترميز مقاومة المضادات الحيوية والبروتين الفلوري الأخضر (GFP). الاعتماد على هذه الاستراتيجية يمكن أن يكون معقدا عند استهداف الجينات داخل operons polycistronic بسبب احتمال الآثار القطبية على الجينات المصب. تم تطوير الطفرات الكاسيت الكاسيت تبادل الطفرات (FLAEM)، البروتوكول الذي يرد وصفه هنا، للتخفيف من الآثار القطبية الناجمة عن كاسيت. FLAEM يستخدم تحرير الجينوم كري-loxP لإزالة كاسيت الاختيار بعد الحذف المستهدف من قبل تبادل أليليتش. تحتوي السلالات الناتجة على حذف جين بدون علامات لتسلسل ترميز واحد أو أكثر. تسهل هذه التقنية التقييم المباشر لوظيفة الجينات وتوسع ذخيرة أدوات التلاعب الجيني في C. trachomatis.
Introduction
الكلاميديا التراخورات هي السبب الرئيسي للأمراض المنقولة جنسيا البكتيرية ويمثل عبئا كبيرا على صحة الإنسان. يصاب أكثر من 100 مليون شخص كل عام بـ C. trachomatis1. ما يقرب من 70٪ من الإصابات في النساء هي أعراض على الرغم من الآثار الضارة الصحة الإنجابية، مثل مرض التهاب الحوض، والحمل خارج الرحم، و / أو العقم. تتمة المرض ترتبط مباشرة بعلم المناعة الذي بدأته عدوى التراخوات C. 2. ولا يزال يتعين استحداث لقاح فعال؛ لذلك ، فإن فهم وظيفة عوامل الفوعة البكتيرية وغيرها من المنتجات الجينية البكتيرية هو سؤال بحثي مهم وعاجل.
كما البكتيريا داخل الخلايا، وغزو الخلايا المضيفة، وتكرار داخل الخلايا، والإفراج عن ذرية، والتهرب من الاستجابات المناعية المضيف هي العمليات الحاسمة. C. التراخوفات يشكل غشاء طفيلي ملزمة vacuole, يطلق عليه إدراج, للتنمية داخل الخلايا. يتم تحقيق إنشاء إدراج والعديد من العمليات الحرجة الأخرى عن طريق إفراز البروتينات effector عبر نظام إفراز النوع الثالث (T3SS)3. كان توضيح وظائف هذه المؤثرات المعسرة محدودًا لسنوات عديدة بسبب الاستعصاء الجيني لـ C. trachomatis. على عكس الإشريكية القولونية، فإن العديد من تقنيات الاستنساخ الكلاسيكية لا تنطبق على الكلاميديا. وهناك عدد قليل من القيود الرئيسية التي تنطوي على كفاءة التحول، وعدم وجود مراسلين للاختيار المضاد مثل sacB، وصيانة البلازميد. في حين يمكن الحفاظ على البلازميدات E. coli بشكل عام إلى أجل غير مسمى مع أصل النسخ المتماثل والضغط الانتقائي المناسب ، يتطلب C. trachomatis plasmids ثمانية إطارات قراءة مفتوحة إضافية(pgp1-8) للصيانة التي تم العثور عليها على البلازميد pL2 الأصلي داخل L2 serovar4.
في السنوات الأخيرة كانت هناك العديد من الأدوات الوراثية التي تم إنشاؤها التي تستوعب علم الأحياء الكلاميديا فريدة من نوعها، ومع ذلك لا تزال هناك قيود5،6،7. يمكن أن يؤدي الطفرات الكيميائية عن طريق علاج الميثانسولفونات (EMS) إيثيل التحولات الخاطئة ، أو (أقل تواترا) إلى التحولات النيوكليوتيدإدخال codon وقف سابق لأوانه لتسفر عن طفرة هراء8. الإدراج Transposon هو فعال لتعطيل الجينات، ولكن التكنولوجيا الحالية في أبحاث الكلاميديا شاقة وتستغرق وقتا طويلا9. كل من العلاج EMS وتقنيات الطفرات المتحولة تولد تولد الطفرات العشوائية وتتطلب أساليب فحص صارمة لعزل سلالات متحولة. طريقة لتعطيل الجينات عن طريق إدخال الإنترونات المجموعة الثانية (على سبيل المثال، TargeTron) يسمح لmutagenesis موجهة; ومع ذلك، يتم تقييد هذه الطريقة بالكفاءة، ولا يتم التنبؤ دائمًا بموقع الإدراج بشكل صحيح10.
الفلورسينس ذكرت الطفرات تبادل أليليسيك (FRAEM) هي استراتيجية تستخدم لحذف الجينات المستهدفة إلى جانب إدخال كاسيت الاختيار توفير مقاومة المضادات الحيوية ومراسل الفلورسينس11. ومع ذلك ، فإن FRAEM معقد بسبب احتمال الآثار القطبية الناجمة عن الكاسيت على الجينات المصب ، خاصة عند استهداف الجينات داخل operons المتعددة الأقطاب. Floxed كاسيت allelic تبادل الطفرات (FLAEM) هو نهج وراثي جديد وضعت للتخفيف من الآثار القطبية الناجمة عن كاسيت لوحظ سابقا مع كاسيت اختيار FRAEM12. FLAEM يستخدم تحرير الجينوم كري-loxP لإزالة كاسيت الاختيار واستعادة التعبير عن الجينات المصب. يتم إعادة تصميم كاسيت الاختيار الذي يحتوي على مقاومة المضادات الحيوية والبروتين الفلوري الأخضر (GFP) مع مواقع لوكسب المحيطة. يمكن لهذه المواقع loxP إعادة الجمع في وجود الكري recombinase ويؤدي إلى استئصال كاسيت من الجينوم13. وقد ثبت أن هذه الاستراتيجية للتخفيف من الآثار القطبية الناجمة عن كاسيت عند استهداف tmeA للحذف12،14.
تستخدم كل من أساليب FRAEM و FLAEM نفس ناقل الانتحار ، pSUmC 4.0 ، والذي يمكن الحفاظ عليه بشكل مشروط من خلال التعبير غير القابل للاختزال لـ pgp6. وقد سبق التعبير عن pgp6 ثبت أن تكون ضرورية للاحتفاظ بلازميد، وبالتالي يتم الاستفادة للسيطرة على صيانة البلازميد11،15. عندما يتم زراعة C. trachomatis في وسائل الإعلام تستكمل مع التتراسيكلين اللامائية (aTc) للحث على التعبير pgp6، يتم الحفاظ على ناقلات. في حالة عدم وجود aTc، يتم فقدان المتجه. يتم تحقيق حذف الجينات المستهدفة من خلال التبادل الآلي للجين لكاسيت الاختيار. 3 كيلوبايت المناطق مباشرة المنبع والمصب من الجين المستهدف بمثابة الأسلحة homology لإعادة التركيب. يتم استنساخ هذه الأسلحة في pSUmC 4.0 ناقلات تحيط كاسيت الاختيار. ويلاحظ نجاح C. التحول القصبة الهوائية والأحداث إعادة التركيب من خلال الإبلاغ عن الفلورسينس. التعبير عن mCherry على العمود الفقري للمتجه وgfp داخل كاسيت الاختيار تسفر عن إدراجات الفلورسنت الحمراء والخضراء. بمجرد إزالة aTc من وسائط الثقافة ، تشير التضمينات الخضراء فقط إلى أحداث إعادة التركيب الناجحة مع فقدان ناقل الانتحار ودمج كاسيت الاختيار في الجينوم البكتيري.
FLAEM يمثل امتدادا لFRAEM عن طريق التحول اللاحق لناقلات الكري المؤافر ة ، pSU – Cre ، في سلالة متحولة تم إنشاؤها حديثا. Cre recombinase يسهل إعادة التركيب بين مواقع loxP واستئصال كاسيت الاختيار. تتم الإشارة إلى أحداث إعادة التركيب من خلال الإبلاغ عن الفلورسينس. ناقلات PSU-Cre ترميز mCherry; وبالتالي ، يشار إلى التحول الناجح من خلال إضافة الفلورية الحمراء إلى gfp– التعبير عن التضمينات. الزراعة في غياب ضغط انتقائي للكاسيت النتائج في Rere بوساطة إعادة التركيب في مواقع loxP، ويشار إلى فقدان الكاسيت من خلال إدراجات حمراء فقط. كما هو الحال مع pSUmC-4.0، يتم استخدام التعبير غير القابل للاختزال من pgp6 للحفاظ على PSU-Cre بشكل مشروط. مرة واحدة تتم إزالة aTc واختيار المضادات الحيوية، يتم علاج البلازميد، وسلالة الحذف علامة الناتجة غير الفلورسنت. وتتناول هذه الطريقة مسألة الآثار القطبية الناجمة عن الكاسيت.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الموصوف هنا لتوليد حذف الجينات بدون علامات في C. trachomatis من قبل FLAEM يسمح الحذف المستهدف للجينات غير الأساسية ويزيل الآثار القطبية الناجمة عن الكاسيت. يعتمد البروتوكول على التصميم الدقيق لأذرع الهومنولوجيا 5 ‘و 3’ التي تم إدخالها في ناقل الانتحار pSUmC 4.0 ، والتحول الفعال لـ C. tra…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح خدمات الصحة العامة من المعهد الوطني للصحة ، NIAID (المنح A1065530 و Al124649) ، إلى حقول ك.
Materials
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Molecular Biology Grade |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Buffer | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | C7902-500G | Suitable for cell culture |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam–/dcm– Competent E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterile filtered cell culture tested |
| Glutamic acid | Sigma | G8415-100G | L-Glutamic acid |
| Growth Media #1 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS). | ||
| Growth Media #2 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Sodium phosphate monobasic |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Sodium phosphate dibasic |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | Bioreagent suitable for cell culture |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Containing 2mM L-glutamine |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin | ||
| Selection Media #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin | ||
| Sodium Acetate Buffer Solution | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent suitable for cell culture |
| Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) | 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure grade |
| Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture |
References
- World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, 207-208 (2012).
- Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
- Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
- Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239 (2009).
- Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
- Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).
- Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
- LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10 (4), 01343 (2019).
- Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989 (2013).
- Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817 (2016).
- Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479 (2018).
- Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
- McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85 (12), 00640 (2017).
- Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).
- Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
- Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142 (2013).
- Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).
