Eliminación de genes sin marcadores por Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis en Chlamydia trachomatis
Summary
Aquí se describe un método para la eliminación de genes dirigida y sin marcadores en Chlamydia trachomatis mediante mutagénesis de intercambio alélico de casete floxed, FLAEM.
Abstract
La clamidia trachomatis es un patógeno intracelular obligatorio que ha sido históricamente difícil de manipular genéticamente. El progreso definitivo en la esclarecimiento de los mecanismos que C. trachomatis utiliza para crear y mantener un nicho intracelular privilegiado se ha limitado debido a la falta de herramientas genéticas. Afortunadamente, recientemente ha habido varios avances nuevos en las técnicas de manipulación genética. Entre ellos se encuentra el desarrollo de mutagénesis de intercambio alélico reportada por fluorescencia (FRAEM). Este método permite la eliminación de genes dirigida junto con la inserción de un casete de selección que codifica resistencia a los antibióticos y proteína fluorescente verde (GFP). La confianza en esta estrategia puede ser complicada cuando se dirige a genes dentro de operines policistricos debido al potencial de efectos polares en genes aguas abajo. Mutagénesis de intercambio alélico de casete floxed (FLAEM), el protocolo para el que se describe aquí, fue desarrollado para aliviar los efectos polares inducidos por casete. FLAEM utiliza la edición del genoma Cre-loxP para eliminar el casete de selección después de la eliminación dirigida por intercambio alélico. Las cepas resultantes contienen eliminaciones genéticas sin marcadores de una o más secuencias de codificación. Esta técnica facilita la evaluación directa de la función génica y amplía el repertorio de herramientas para la manipulación genética en C. trachomatis.
Introduction
La clamidia trachomatis es la principal causa de enfermedad bacteriana de transmisión sexual y representa una carga significativa para la salud humana. Más de 100 millones de personas se infectan cada año con C. trachomatis1. Aproximadamente el 70% de las infecciones en las mujeres son asintomáticas a pesar de los efectos perjudiciales para la salud reproductiva, como la enfermedad inflamatoria pélvica, el embarazo ectópico o la infertilidad. La secuencia de la enfermedad está directamente relacionada con la inmunopatología iniciada por la infección por C. trachomatis 2. Aún no se ha desarrollado una vacuna eficaz; por lo tanto, comprender la función de los factores de virulencia bacteriana y otros productos genéticos bacterianos es una cuestión de investigación importante y urgente.
Como bacterias intracelulares, la invasión de células huésped, la replicación intracelular, la liberación de progenie y la evasión de las respuestas inmunológicas del huésped son procesos críticos. C. trachomatis forma una vacuola ligada a la membrana parasitoforo, denominada inclusión, para el desarrollo intracelular. Establecimiento de la inclusión y muchos otros procesos críticos se logran mediante la secreción de proteínas efectoras a través de un sistema de secreción tipo III (T3SS)3. Elaludar las funciones de estos efectores secretados fue limitada durante muchos años debido a la intractabilidad genética de C. trachomatis. A diferencia de E. coli, muchas técnicas clásicas de clonación no son aplicables a la clamidia. Algunas limitaciones importantes implican la eficiencia de la transformación, la falta de reporteros de contraselección como sacB y mantenimiento de plásmidos. Mientras que los plásmidos de E. coli generalmente pueden mantenerse indefinidamente con un origen de replicación y una presión selectiva adecuada, C. trachomatis plásmido requiere ocho marcos de lectura abiertos adicionales (pgp1-8) para el mantenimiento que se encuentran en el plásmido pL2 nativo dentro del l2 serovar4.
En los últimos años se han generado múltiples herramientas genéticas que acomodan la biología única de La clamidia, pero todavía hay limitaciones5,6,7. La mutagénesis química por tratamiento de metanosulfonato etílico (EMS) puede introducir mutaciones erróneas, o (con menos frecuencia) puede dar lugar a transiciones de nucleótidos que introducen un codón de parada prematuro para producir una mutación sin sentido8. La inserción de transposon es eficiente para la interrupción de genes, pero la tecnología actual en la investigación de la clamidia es laboriosa y requiere mucho tiempo9. Tanto el tratamiento del SME como las técnicas de mutagénesis de transposón generan mutaciones aleatorias y requieren métodos de detección rigurosos para aislar las cepas mutantes. Un método para interrumpir genes mediante la inserción de intrones de grupo II (por ejemplo, TargeTron) permite la mutagénesis dirigida; sin embargo, este método está limitado por la eficiencia, y el sitio de inserción no siempre se predice correctamente10.
Mutagénesis de intercambio alélico reportada por fluorescencia (FRAEM) es una estrategia utilizada para la eliminación de genes dirigido según la inserción de un casete de selección que proporciona resistencia a los antibióticos y un reportero de fluorescencia11. Sin embargo, la FRAEM se complica por el potencial de los efectos polares inducidos por casetes en genes aguas abajo, especialmente cuando se dirige a genes dentro de operons policistricos. La mutagénesis del intercambio alélico de casete floxed (FLAEM) es un novedoso enfoque genético desarrollado para aliviar los efectos polares inducidos por casete observados previamente con el casete de selección FRAEM12. FLAEM utiliza la edición del genoma De xalo para eliminar el casete de selección y restaurar la expresión de genes aguas abajo. El casete de selección que contiene resistencia a los antibióticos y proteína fluorescente verde (GFP) se ha rediseñado con sitios loxP flanqueantes. Estos sitios loxP pueden recombinarse en presencia de Cre recombinase y dar lugar a la escisión del casete del genoma13. Esta estrategia se ha demostrado para aliviar los efectos polares inducidos por el casete al apuntar a tmeA para la eliminación12,14.
Los métodos FRAEM y FLAEM utilizan el mismo vector suicida, pSUmC 4.0, que se puede mantener condicionalmente mediante la expresión inducible de pgp6. Anteriormente se ha demostrado que la expresión de pgp6 es necesaria para la retención de plásmidos y, por lo tanto, se aprovecha para controlar el mantenimiento del plásmido11,15. Cuando C. trachomatis se cultiva en medios complementados con tetraciclina anhidra (aTc) para inducir la expresión pgp6, se mantiene el vector. En ausencia de aTc, el vector se pierde. La eliminación de genes dirigida se logra mediante el intercambio alélico del gen para el casete de selección. Las regiones de 3 kb directamente aguas arriba y aguas abajo del gen dirigido sirven como brazos homológicos para la recombinación. Estos brazos se clonan en el vector pSUmC 4.0 que flanquea el casete de selección. Los eventos exitosos de transformación y recombinación de C. trachomatis se observan a través de informes de fluorescencia. La expresión de mCherry en la columna vertebral vectorial y gfp dentro del casete de selección producen inclusiones fluorescentes rojas y verdes. Una vez que aTc se elimina de los medios de cultivo, las inclusiones de solo verde indican eventos de recombinación exitosos con la pérdida del vector suicida y la integración del casete de selección en el genoma bacteriano.
FLAEM representa una extensión de FRAEM a través de la transformación posterior de un vector cúdita-expresión de la recombinación Cre, pSU-Cre, en la cepa mutante recién creada. Cre recombinase facilita la recombinación entre los sitios loxP y la escisión del casete de selección. Los eventos de recombinación se indican mediante informes de fluorescencia. El vector pSU-Cre codifica mCherry; por lo tanto, la transformación exitosa se indica mediante la adición de fluorescencia roja a gfp-expresando inclusiones. El cultivo en ausencia de presión selectiva para el cassette da como resultado una recombinación mediada por Cre en los sitios loxP, y la pérdida del cassette se indica mediante inclusiones solo rojas. Al igual que con pSUmC-4.0, la expresión inducible de pgp6 se utiliza para mantener condicionalmente pSU-Cre. Una vez que se retiran las selecciones de aTc y antibióticos, el plásmido se cura y la cepa de eliminación sin marcadores resultante no es fluorescente. Este método aborda el problema de los efectos polares inducidos por casete.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí para la generación de deleciones de genes sin marcadores en C. trachomatis por FLAEM permite la eliminación dirigida de genes no esenciales y elimina los efectos polares inducidos por casete. El protocolo se basa en el diseño cuidadoso de los brazos de homología de 5′ y 3′ insertados en el vector suicida pSUmC 4.0, la transformación eficiente de C. trachomatis, y la detección cuidadosa de cepas mutantes aisladas. La ingeniería exitosa del genoma a través de este méto…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Servicio de Salud Pública del Instituto Nacional de Salud, NIAID (becas A1065530 y Al124649), a K.A. Fields.
Materials
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Molecular Biology Grade |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Buffer | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | C7902-500G | Suitable for cell culture |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam–/dcm– Competent E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterile filtered cell culture tested |
| Glutamic acid | Sigma | G8415-100G | L-Glutamic acid |
| Growth Media #1 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS). | ||
| Growth Media #2 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Sodium phosphate monobasic |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Sodium phosphate dibasic |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | Bioreagent suitable for cell culture |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Containing 2mM L-glutamine |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin | ||
| Selection Media #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin | ||
| Sodium Acetate Buffer Solution | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent suitable for cell culture |
| Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) | 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure grade |
| Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture |
References
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