Her presenterer vi en protokoll for å måle eIF4E-eIF4G-interaksjon i levende celler som vil gjøre det mulig for brukeren å evaluere legemiddelindusert perturbasjon av eIF4F-kompleks dynamikk i screeningformater.
Dannelse av eIF4F-komplekset har vist seg å være nøkkelen nedstrøms node for konvergens av signalveier som ofte gjennomgår onkogen aktivering hos mennesker. eIF4F er et cap-bindende kompleks involvert i mRNA-ribosomet rekrutteringsfasen av oversettelsesinitiering. I mange cellulære og prekliniske kreftmodeller fører dereguleringen av eIF4F til økt oversettelse av spesifikke mRNA-undergrupper som er involvert i kreftproliferasjon og overlevelse. eIF4F er et hetero-trimerisk kompleks bygget av den cap-bindende underenheten eIF4E, helicase eIF4A og stillasunderenheten eIF4G. Kritisk for montering av aktive eIF4F-komplekser er proteinproteininteraksjonen mellom eIF4E- og eIF4G-proteiner. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for å måle eIF4F-montering som overvåker statusen til eIF4E-eIF4G-interaksjon i levende celler. Den eIF4e:4G cellebaserte proteinproteininteraksjonsanalysen gjør det også mulig å vurdere legemiddelinduserte endringer i eIF4F-kompleks integritet nøyaktig og pålitelig. Vi ser for oss at denne metoden kan brukes til å verifisere aktiviteten til kommersielt tilgjengelige forbindelser eller for videre screening av nye forbindelser eller modaliteter som effektivt forstyrrer dannelsen av eIF4F-komplekset.
Kontroll av genuttrykk spiller en sentral rolle i riktig utførelse av cellulære programmer som vekstproliferasjon og differensiering. En regulatorisk kontrollmekanisme kan utøves enten på nivået av gentranskripsjon eller på nivået av mRNA-oversettelse. I løpet av det siste tiåret har det blitt stadig tydeligere at translasjonskontroll ved modulering av initieringsprosessen i stedet for de senere trinnene for forlengelse og oppsigelse kan regulere syntesen av spesifikke undergrupper av proteiner som spiller et bredt spekter av biologiske funksjoner.
Økt oversettelse av mRNAer involvert i overlevelse, anti-autofagiske og anti-apoptotiske responser har blitt involvert i flere kreftformer og har også vært årsaksmessig knyttet til enten avvikende aktivering eller over uttrykk for oversettelse initieringsfaktorer1.
eIF4F-komplekset er en hovedregulator for oversettelsesstart. Ved å binde cap-strukturen på 5′ enden av mRNAs, eIF4F kjører innledende mRNA-ribosome rekruttering og i sin tur øke mRNA oversettelse effektivitet av svakt oversatt eukaryotic mRNAs2. eIF4F mediert oversettelse av kreftrelaterte mRNAer er rapportert for mange kreftmodeller som har avvikende aktivering av RAS/MAPK- eller AKT/TOR-veier, noe som tyder på at kreftceller oppregulerer eIF4F for å øke sin egen pro-neoplastiske aktivitet. Forstyrrelse av denne feed-forward sløyfen ved å hemme eIF4F kompleks dannelse er dermed en svært lovende terapeutisk strategi3,4.
eIF4F-komplekset består av (i) eIF4E, cap-bindende underenhet av eIF4F som samhandler med hettestrukturen som finnes ved 5′ UTR av mRNA, (ii) eIF4A, RNA-helikase og (iii) eIF4G, stillasproteinet som samhandler med både eIF4A og eIF4E og som til slutt rekrutterer 40S ribosomal subenhet5. eIF4G-tilknytning til eIF4E er det hastighetsbegrensende trinnet for montering av funksjonelle eIF4F-komplekser, og det er negativt regulert av eIF4E-bindende proteiner (4EBPer, medlem 1, 2 og 3))6. Ved å konkurrere med eIF4G-binding til eIF4E gjennom et grensesnitt som består av kanoniske og ikke-kanoniske eIF4E-bindingssekvenser7,8,9 (region som spenner over aa 604-646 på human eIF4E), reduserer 4EBP utvalget av eIF4E som er aktivt involvert i oversettelse og forhindrer eIF4F-kompleks dannelse. Samspill mellom disse proteinproteininteraksjonene er hovedsakelig regulert av pattedyrmålet for rapamycin (mTOR)-mediert fosforylering av 4EBP. Ved mitogene stimuli, mTOR direkte fosforylater medlemmene av 4E-BP proteinfamilien, reduserer deres tilknytning til eIF4E og dermed fremmer eIF4E-eIF4G interaksjon og dannelse av funksjonelle eIF4F komplekser10.
Til tross for den store innsatsen i å utvikle forbindelser rettet mot eIF4F kompleks integritet, har mangelen på analyser som måler direkte forstyrrelse av eIF4E-eIF4G-interaksjon i levende celler begrenset søket etter cellulære aktive treffforbindelser. Vi har brukt en luciferaseanalyse basert på en coelenterazin-analog (f.eks. Nanoluc-basert komplementasjonsanalyse) for å overvåke statusen til eIF4F-integriteten i sanntid gjennom eIF4E-eIF4G-interaksjonen. Luciferase komplementering protein system består av en 18 kDa protein fragment (SubA) og 11 aminosyre peptid fragment (SubB) optimalisert for minimal selv-assosiasjon og stabilitet11. Når det uttrykkes som et fusjonsprodukt med eIF4E i full lengde og eIF4E-interaksjonsdomenet fra humant eiF4G1 (aa 604-646), vil de to interagerende proteinene bringe SubA- og SubB-fragmentet i nærheten av hverandre og vil indusere dannelsen av den aktive luciferase som i nærvær av et cellegjennomtrengelig substrat til slutt vil generere et sterkt lysende signal (Figur 1). Vi har rapportert andre steder bygging og validering av eIF4E: eIF4G604-646 komplementeringssystem16.
Her beskriver vi hvordan eIF4E:eIF4G604-646 komplementasjonssystem (tilgjengelig på forespørsel) kan brukes til å måle nøyaktig 4EBP1-mediert eIF4E-eIF4G-forstyrrelse i levende celler. I tillegg demonstrerer vi nytten ved å måle effekten av flere mTOR-hemmere som for tiden er under kliniske studier som potensielle kreftterapeutiske legemidler12. Fordi off-target effekter ofte maskerer narkotikaspesifikk aktivitet, beskriver vi også hvordan allsidigheten til eIF4E:eIF4G604-646 systemmåling kan utvides med ortogonale målinger av cellulær levedyktighet for å ta hensyn til disse.
Metoden beskrevet i denne artikkelen bruker en luciferase-basert komplementeringsanalyse for kvantitativt å overvåke eIF4F kompleks montering gjennom direkte måling av eIF4G-eIF4E interaksjon i levende celler. Vi har gitt detaljer for bruk av eIF4E-eIF4G komplementeringssystem, og vi har også vist at systemet er ekstremt nøyaktig i måling av legemiddelindusert 4EBP1-mediert dissosiasjon av eIF4E-eIF4G interaksjon16. For å lette gjennomstrømningen av denne analysen, er det eksperimentelle o…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av kjernebudsjettet fra p53lab (BMSI, A *STAR) og JCO VIP grant (A *STAR).
293FT cells | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
Cell culture microplate 96 well, F-Bottom | greiner bio-one | 655083 | |
Cell titer Glo 2.0 | PROMEGA | G9241 | |
Envision Multilabel Reader | PerkinElmer | not applcable | |
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662070 | |
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662050 | |
FUGENE6 | PROMEGA | E2692 | |
Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
NanoBiT PPI Starter Systems | PROMEGA | N2014 | |
Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
Orbital shaker | Eppendorf | not appicable | |
γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose | Jena Bioscience | AC-155S |