Övervakning av eIF4F-sammansättning genom mätning av eIF4E-eIF4G-interaktion i levande celler

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att mäta eIF4E-eIF4G-interaktion i levande celler som skulle göra det möjligt för användaren att utvärdera läkemedelsinducerad störd eIF4F-komplex dynamik i screeningformat.

Abstract

Bildandet av eIF4F-komplexet har visat sig vara den viktigaste nedströmsnoden för konvergens av signalvägar som ofta genomgår onkogen aktivering hos människor. eIF4F är ett kap-bindande komplex som är involverat i mRNA-ribosome rekryteringsfasen av översättningsinitiering. I många cellulära och prekliniska modeller av cancer leder avregleringen av eIF4F till ökad översättning av specifika mRNA-undergrupper som är involverade i cancerspridning och överlevnad. eIF4F är ett hetero-trimeriskt komplex byggt av den kapbindande underenheten eIF4E, helicase eIF4A och byggnadsställningsunderenheten eIF4G. Avgörande för montering av aktiva eIF4F-komplex är protein-proteininteraktionen mellan eIF4E- och eIF4G-proteiner. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för att mäta eIF4F-sammansättning som övervakar statusen för eIF4E-eIF4G-interaktion i levande celler. EIF4e:4G cellbaserad protein-protein interaktionsanalys gör det också möjligt att noggrant och tillförlitligt bedöma läkemedelsinducerade förändringar i eIF4F komplexa integritet. Vi föreställer oss att denna metod kan tillämpas för att verifiera aktiviteten hos kommersiellt tillgängliga föreningar eller för ytterligare screening av nya föreningar eller modaliteter som effektivt stör bildandet av eIF4F-komplex.

Introduction

Kontroll av genuttryck spelar en central roll i korrekt utförande av cellulära program såsom tillväxt spridning och differentiering. En reglerande kontrollmekanism kan utövas antingen på genkriberingsnivå eller på nivån för mRNA-översättning. Under det senaste decenniet har det blivit alltmer uppenbart att translationell kontroll genom modulering av initieringsprocessen snarare än de senare stegen av förlängning och avslutning fint kan reglera syntesen av specifika delmängder av proteiner som spelar ett brett spektrum av biologiska funktioner.

Ökad översättning av mRNAs som är involverade i överlevnad, anti-autophagic och anti-apoptotic svar har varit inblandade i flera cancerformer och har också varit kausativt kopplade till antingen avvikande aktivering eller över uttryck för översättning inledande^{faktorer 1}.

EIF4F-komplexet är en huvudregulator för översättningsinitiering. Genom att binda kap-strukturen i 5′ änden av mRNAs, eIF4F driver inledande mRNA-ribosom rekrytering och i sin tur öka mRNA översättning effektivitet av svagt översatta eukaryotic mRNAs². eIF4F-förmedlad översättning av cancerrelaterade mRNAs har rapporterats för många cancermodeller som hyser avvikande aktivering av RAS/ MAPK eller AKT / TOR-vägar, vilket tyder på att cancerceller uppreglerar eIF4F för att öka sin egen pro-neoplastiska aktivitet. Störning av denna feed-forward loop genom att hämma eIF4F komplexa bildandet är därmed en mycket lovande terapeutisk strategi^3,4.

EIF4F-komplexet består av i) eIF4E, Den kapbindande underenheten i eIF4F som interagerar med den takstruktur som finns vid mRNA:s 5′ UTR, ii) eIF4A, RNA-helicase och iii) eIF4G, ställningsproteinet som interagerar med både eIF4A och eIF4E och som så småningom rekryterar 40S ribosomalunderenhet^5. eIF4G-associering med eIF4E är det hastighetsbegränsande steget för montering av funktionella eIF4F-komplex och det regleras negativt av eIF4E-bindande proteiner (4EBPs, medlemmar 1, 2 och 3))⁶. Genom att konkurrera med eIF4G-bindning till eIF4E genom ett gränssnitt som består av kanoniska och icke-kanoniska eIF4E-bindningssekvenser^7,8,9 (region som sträcker sig över aa 604-646 på human eIF4E), minskar 4EBP poolen av eIF4E som aktivt deltar i översättning och förhindrar eIF4F-komplexbildning. Samspelet mellan dessa proteinproteininteraktioner regleras huvudsakligen av däggdjursmålet rapamycin (mTOR)-medierad fosforylering av 4EBP. Vid mitogena stimuli fosforylerar mTOR direkt medlemmarna i proteinfamiljen 4E-BP, minskar deras koppling till eIF4E och därigenom främjar eIF4E-eIF4G-interaktion och bildandet av funktionella eIF4F-komplex¹⁰.

Trots den stora ansträngningen att utveckla föreningar riktade mot eIF4F komplexa integritet, bristen på analyser som mäter direkta störningar av eIF4E-eIF4G interaktion i levande celler har begränsat sökandet efter cellulära aktiva hit föreningar. Vi har tillämpat en luciferasanalys baserad på en coelenterazinanalog (t.ex. Nanoluc-baserad komplementeringsanalys) för att i realtid övervaka statusen för eIF4F-integritet genom eIF4E-eIF4G-interaktionen. Luciferase komplementering protein systemet består av en 18 kDa protein fragment (SubA) och 11 aminosyra peptid fragment (SubB) optimeras för minimal självanslutning och stabilitet¹¹. En gång uttryckt som en fusionsprodukt med den mänskliga fulllängds eIF4E och eIF4E-interaktionsdomänen från human eiF4G1 (aa 604-646) kommer de två interagerande proteinerna att föra SubA- och SubB-fragmentet i närheten av varandra och kommer att inducera bildandet av den aktiva luciferasen som, i närvaro av ett cellpermeabelt substrat, så småningom kommer att generera en ljus luminescent signal (figur 1). Vi har på annat håll rapporterat om konstruktion och validering av eIF4E:eIF4G^604-646 komplementeringssystem¹⁶.

Här beskriver vi hur eIF4E:eIF4G^604-646 komplementeringssystem (tillgängligt på begäran) kan tillämpas för att korrekt mäta 4EBP1-medierad eIF4E-eIF4G-störning i levande celler. Dessutom visar vi dess nytta genom att mäta effekterna av flera mTOR-hämmare som för närvarande är under kliniska prövningar som potentiella cancerterapeutiska läkemedel¹². Eftersom effekter utanför målet ofta maskerar läkemedelsspecifik aktivitet beskriver vi också hur mångsidigheten hos systemmätningen eIF4E:eIF4G^604-646 kan utökas med ortogonala mätningar av cellulär livskraft för att ta hänsyn till dessa.

Protocol

HEK293 cellinje användes för protokollet och odlades i Dulbeccos modifierade eagle medium kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum, 2 mM L-glutamin och 100 U/mL penicillin/streptomycin. Cellerna odlades vid 37 °C med 5% CO2 i en fuktad miljö. 1. Kvantitativ bedömning av eIF4F-komplexa störningar via eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringsanalys Cellkultur och övergående transfektion av eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringsanalys Använd…

Representative Results

För att validera känsligheten hos eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystem bedömdes 4EBP1-medierad hämning av eIF4F-komplex montering med hjälp av mTOR-hämmare. Genom att hämma mTORC1-kinasberoende fosforylering av 4EBP-proteinfamiljen förstärker mTOR-hämningen 4EBP1-associationen till eIF4E och därmed eIF4F demontering15. Två klasser av mekanistiskt olika hämmare av mTOR-kinaser testades: rapaloger (t.ex. Rapamycin) som är allosteriska h?…

Discussion

Metoden som beskrivs i denna artikel använder en luciferase-baserad komplementeringsanalys för att kvantitativt övervaka eIF4F-komplex montering genom direkt mätning av eIF4G-eIF4E-interaktion i levande celler. Vi har lämnat detaljer för användning av eIF4E-eIF4G komplementeringssystem och vi har också visat att systemet är extremt exakt vid mätning av läkemedelsinducerad 4EBP1-medierad dissociation av eIF4E-eIF4G interaktion¹⁶. För att underlätta genomströmningen av denna analys har…

Materials

293FT cells	Thermo Fisher Scientific	R70007
Cell culture microplate 96 well, F-Bottom	greiner bio-one	655083
Cell titer Glo 2.0	PROMEGA	G9241
Envision Multilabel Reader	PerkinElmer	not applcable
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml	Thermo Fisher Scientific	4662070
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml	Thermo Fisher Scientific	4662050
FUGENE6	PROMEGA	E2692
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000015
NanoBiT PPI Starter Systems	PROMEGA	N2014
Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	11058021
Orbital shaker	Eppendorf	not appicable
γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose	Jena Bioscience	AC-155S