Panel LC-MS/MS validado para cuantificar 11 medicamentos resistentes a la tuberculosis en muestras de pelo pequeño
Summary
Los métodos actuales para analizar la adherencia de los pacientes a regímenes complejos de tuberculosis farmacorresistente (DR-TB) pueden ser inexactos e intensivos en recursos. Nuestro método analiza el cabello, una matriz fácilde de recoger y almacenar, para concentraciones de 11 medicamentos DR-TB. Usando LC-MS/MS, podemos determinar los niveles de fármacos subnanogramos que se pueden utilizar para entender mejor la adherencia a los medicamentos.
Abstract
La tuberculosis farmacorresistente (TB-DR) es una amenaza creciente para la salud pública, y la evaluación de los niveles de medicamentos terapéuticos puede tener importantes beneficios clínicos. Los niveles de fármacos plasmáticos son la evaluación estándar de oro actual, pero requieren flebotomía y una cadena de frío, y capturan sólo una adherencia muy reciente. Nuestro método utiliza el cabello, una matriz que se recoge fácilmente y refleja la adherencia a largo plazo, para probar 11 medicamentos antituberculosos. El trabajo previo de nuestro grupo muestra que los niveles de medicamentos antirretrovirales en el cabello están asociados con los resultados del VIH. Nuestro método para fármacos DR-TB utiliza 2 mg de cabello (3 cm proximal a la raíz), que se pulveriza y se extrae en metanol. Las muestras se analizan con un único método LC-MS/MS, cuantificando 11 fármacos en una carrera de 16 minutos. Los límites más bajos de cuantificación (LLOQ) para los 11 fármacos oscilan entre 0,01 ng/mg y 1 ng/mg. La presencia de fármacos se confirma comparando las relaciones de dos transiciones de espectrometría de masas. Las muestras se cuantifican utilizando la relación de área del fármaco con la isotopotopopotopopoca delaterated, 15N-, o 13Con etiqueta C. Utilizamos una curva de calibración que va desde 0.001-100 ng/mg. La aplicación del método a una muestra de conveniencia de muestras capilares recogidas de pacientes con TB-DR en terapia observada directamente (DOT) indicó niveles de fármacos en el cabello dentro del rango dinámico lineal de nueve de los once fármacos (isoniazida, pirazinamida, ethambutol, linezolid, levofloxacino, moxifloxacino, clofazimine, bedaquilina, pretomanide). Ningún paciente estaba tocando protionamida, y los niveles medidos de etionamida estaban cerca de su LLOQ (con trabajo adicional en lugar de examinar la idoneidad del metabolito de etionamida para monitorear la exposición). En resumen, describimos el desarrollo de un panel multianálisis para fármacos contra la TUBERCULOSIS en el cabello como una técnica para el monitoreo terapéutico de fármacos durante el tratamiento de la tuberculosis farmacorresistente.
Introduction
En el siglo XXI, la tuberculosis farmacorresistente (TB-DR) es una catástrofe en evolución para los ya débiles programas nacionales de control de la tuberculosis, con casos confirmados que se duplican solo en los últimos 5 años, lo que representa casi un tercio de todas las muertes relacionadas con la resistencia a los antimicrobianos en todo el mundo1,2. El tratamiento exitoso de la TB-DR ha requerido convencionalmente regímenes de segunda línea más largos y tóxicos que el tratamiento para la tuberculosis sensible a los medicamentos. Además, los pacientes con TB-DR a menudo tienen importantes desafíos preexistentes a la adherencia, lo que contribuyó a la aparición de resistencia inicialmente3.
A diferencia de la infección por VIH, en la que se pueden utilizar cargas virales para controlar el tratamiento, las variables sustitutas de la respuesta al tratamiento en la tuberculosis se retrasan y no son fiables en un nivel individual4. El control de la adherencia de los pacientes, un importante predictor de la concentración de fármacos antituberculosos y la insuficiencia del tratamiento, también es un desafío. La adherencia autoinformada sufre de sesgo de recuerdo y el deseo de complacer a los proveedores5,,6. Los recuentos de píldoras y los sistemas de monitoreo de eventos de medicamentos (MEMS) pueden ser más objetivo7 pero no miden el consumo real de drogas8,9,10. Los niveles de fármacos en las biomatrices pueden proporcionar datos de adherencia y farmacocinéticos. Por lo tanto, los niveles plasmáticos de fármacos se utilizan comúnmente en la monitorización terapéutica de fármacos11,12. Sin embargo, en el contexto de la monitorización de la adherencia a los medicamentos, los niveles plasmáticos representan una exposición a corto plazo y están limitados por una variabilidad significativa dentro e interpaciente al determinar el rango de referencia de adherencia adecuado. Efectos de “capa blanca”, donde la adherencia mejora antes de las visitas a la clínica o al estudio, complica aún más la capacidad de los niveles plasmáticos para proporcionar patrones precisos de adherencia a los medicamentos13.
El cabello es una biomatriz alternativa que puede medir la exposición a largo plazo a fármacos14,,15. Muchos fármacos y metabolitos endógenos se incorporan a la matriz de proteína capilar de la circulación sistémica a medida que crece el cabello. A medida que este proceso dinámico continúa durante el crecimiento del cabello, la cantidad de droga depositada en la matriz capilar depende de la presencia continua de la droga en circulación, haciendo del cabello una excelente lectura temporal de la ingesta de drogas. El cabello como biomatriz tiene la ventaja adicional de ser fácilmente recogido sin la necesidad de cadena de frío para el almacenamiento y el envío en comparación con la sangre. Además, el cabello no es biopeligroso, lo que proporciona ventajas de viabilidad adicionales en el campo.
Los niveles de drogas capilares se han utilizado durante mucho tiempo en aplicaciones forenses16. Durante la última década, los niveles de antirretroviral del cabello han demostrado utilidad en la evaluación de la adherencia a las drogas en el tratamiento y la prevención del VIH, a lo que nuestro grupo contribuyó. Se ha demostrado que los niveles de ARV en el cabello son los predictores independientes más fuertes de los resultados del tratamiento en la infección por VIH17,18,19,20,21. Para determinar si los niveles capilares de pacientes con TB-DR tendrán la misma utilidad para predecir el resultado del tratamiento, utilizamos LC-MS/MS para desarrollar y validar un método para analizar 11 medicamentos de TB-DR en muestras de cabello pequeño. Como evaluación inicial del rendimiento del ensayo, medimos los niveles de fármacos contra la tuberculosis retro en una muestra de conveniencia de pacientes con TB-DR que reciben terapia observada directamente (DOT) en el Cabo Occidental, Sudáfrica22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí informamos del protocolo para el método que desarrollamos y validamos para cuantificar 11 medicamentos anti-TB utilizados en el tratamiento de la TB-DR en muestras de cabello pequeño utilizando LC-MS/MS. Ningún otro método para cuantificar estos 11 fármacos en el cabello ha sido previamente desarrollado, validado y publicado. Nuestro método puede cuantificar los niveles de subnanogramos de fármacos en sólo 20-30 hebras de cabello de aproximadamente 3 centímetros (cm) de longitud (2 mg) y ya ha sido validad…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quisieran dar las gracias al profesor Keertan Dheda, al Dr. Ali Esmail y Marietjie Pretorius en el Instituto de Pulmón de la Universidad de Ciudad del Cabo, quien facilitó la recolección de muestras de cabello para el estudio. Los autores agradecen además las contribuciones de los participantes de este estudio.
Materials
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
References
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