Valideret LC-MS/MS Panel til kvantificering af 11 resistente TB-medicin i små hårprøver
Summary
De nuværende metoder til analyse af patienternes overholdelse af komplekse resistente tuberkulose (DR-TB) regimer kan være unøjagtige og ressourcekrævende. Vores metode analyserer hår, en let indsamlet og lagret matrix, for koncentrationer af 11 DR-TB medicin. Ved hjælp af LC-MS/MS, Vi kan bestemme sub-nanogram narkotika niveauer, der kan udnyttes til bedre at forstå narkotika overholdelse.
Abstract
Lægemiddelresistent tuberkulose (DR-TB) er en voksende trussel mod folkesundheden, og vurdering af terapeutiske lægemiddelniveauer kan have betydelige kliniske fordele. Plasma stof niveauer er den nuværende guld standard vurdering, men kræver phlebotomi og en kold kæde, og fange kun meget nylig tilslutning. Vores metode bruger hår, en matrix, der er let indsamlet og afspejler langsigtet overholdelse, at teste for 11 anti-TB medicin. Tidligere arbejde af vores gruppe viser, at antiretrovirale lægemiddelniveauer i hår er forbundet med hiv-resultater. Vores metode til DR-TB narkotika bruger 2 mg hår (3 cm proksimalt til roden), som er pulveriseret og ekstraheret i methanol. Prøver analyseres med en enkelt LC-MS/MS-metode, kvantificere 11 lægemidler i en 16 min køre. Nedre grænser for kvantificering (LLOQs) for de 11 lægemidler spænder fra 0.01 NG/mg til 1 ng/mg. Narkotika tilstedeværelse bekræftes ved at sammenligne nøgletal af to massespektrometri overgange. Prøver kvantificeres ved hjælp af området forholdet mellem stoffet til deuterated, 15N-, eller 13C-mærket stof isotopologue. Vi brugte en kalibreringskurve fra 0,001 til 100 NG/mg. Anvendelse af metoden på en praktisk prøve af hårprøver indsamlet fra DR-TB patienter på direkte observeret behandling (DOT) angivet lægemiddelniveauer i hår inden for den lineære dynamikområde af ni af de elleve lægemidler (isoniazid, pyrazinamid, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimin, bedaquiline, pretomanid). Ingen patient var på prothionamid, og de målte niveauer for ethionamid lå tæt på lloq -niveauet (i stedet for yderligere arbejde, der undersøgte egnetheden af ethionamids metabolit til overvågning af eksponering). Sammenfattende beskriver vi udviklingen af et multi-analytpanel til DR-TB-lægemidler i hår som en teknik til terapeutisk lægemiddelovervågning under lægemiddelresistent TB-behandling.
Introduction
I det enogtyvende århundrede, resistente TB (DR-TB) er en udvikling katastrofe for allerede svage nationale TB kontrolprogrammer, med bekræftede tilfælde fordobling i de seneste 5 år alene, tegner sig for næsten en tredjedel af alle dødsfald i forbindelse med antimikrobiel resistens globalt1,2. Vellykket behandling af DR-TB har konventionelt krævet længere og mere giftige andenlinjeregimer end behandling for lægemiddelfølsom TB. Desuden har patienter med DR-TB ofte betydelige allerede eksisterende udfordringer med hensyn til overholdelse, hvilket bidrog til fremkomsten af resistens i første omgang3.
I modsætning til hiv-infektion, hvor virusbelastninger kan anvendes til at overvåge behandlingen, er surrogatendepunkter for behandlingsrespons i TB forsinket og upålidelige på individuelt niveau4. Overvågning af patientens overholdelse, en vigtig prædiktor for subterapeutisk anti-TB lægemiddelkoncentration og behandlingssvigt, er også udfordrende. Selvrapporteret overholdelse lider af tilbagekaldelse bias og ønsket om at behage udbydere5,6. Pilletællinger og systemer til overvågning af medicinhændelser (MEMS) kan være mere mål7, men måler ikke det faktiske narkotikaforbrug8,9,10. Drug niveauer i biomatrices kan give både overholdelse og farmakokinetiske data. Derfor er plasma stof niveauer almindeligt anvendt i terapeutisk stof overvågning11,12. I forbindelse med overvågning af lægemiddeloverholdelse repræsenterer plasmaniveauer imidlertid kortvarig eksponering og er begrænset af signifikant e-variation mellem og mellem patienten, når der fastlægges et passende referenceinterval for overholdelse. “White coat” effekter, hvor overholdelse forbedres forud for klinik eller studiebesøg, yderligere komplicerer muligheden for plasma niveauer til at give nøjagtige stof overholdelse mønstre13.
Hår er en alternativ biomatrix, der kan måle langtidseksponering af lægemidler14,15. Mange lægemidler og endogene metabolitter indarbejde i håret protein matrix fra den systemiske omsætning som hår vokser. Da denne dynamiske proces fortsætter under hårvækst, mængden af narkotika deponeret i håret matrix afhænger af den fortsatte tilstedeværelse af stoffet i omløb, hvilket gør håret en fremragende tidsmæssig udlæsning af stofindtag. Hår som en biomatrix har den ekstra fordel at være let indsamlet uden behov for kølekæde til opbevaring og forsendelse i forhold til blod. Desuden hår er ikke-biofarligt, hvilket giver yderligere gennemførlighedsfordele på området.
Hår narkotika niveauer har længe været brugt i retsmedicinske applikationer16. I løbet af de sidste ti år har hår antiretrovirale (ARV) niveauer vist nytte i vurderingen af narkotika overholdelse i hiv-behandling og forebyggelse, som vores gruppe bidraget. ARV-niveauet i håret har vist sig at være de stærkeste uafhængige prædiktorer for behandlingsresultater ved hiv-infektion17,18,19,20,21. For at afgøre, om hårniveauer af DR-TB patienter vil have samme nytte i at forudsige behandlingsresultatet, brugte vi LC-MS/MS til at udvikle og validere en metode til analyse af 11 DR-TB medicin i små hårprøver. Som en indledende vurdering af analysens ydeevne målte vi DR-TB-medicinniveauet i en praktisk prøve af patienter med DR-TB, der fik direkte observeret behandling (DOT) i Western Cape, Sydafrika22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi rapporterer her protokollen for den metode, vi udviklede og validerede til kvantificering af 11 anti-TB medicin, der anvendes til behandling af DR-TB i små hårprøver ved hjælp af LC-MS/MS. Ingen anden metode til kvantificering af disse 11 lægemidler i hår er tidligere blevet udviklet, valideret og offentliggjort. Vores metode kan kvantificere sub-nanogram niveauer af narkotika i kun 20-30 hår tråde på ca 3 centimeter (cm) i længden (~ 2 mg) og er allerede blevet valideret22. Den lave …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke professor Keertan Dheda, Dr. Ali Esmail, og Marietjie Pretorius ved University of Cape Town Lung Institute, der lettede indsamlingen af hår prøver til undersøgelsen. Forfatterne anerkender endvidere taknemmeligt bidragene fra deltagerne i denne undersøgelse.
Materials
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
References
- Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
- Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
- Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, 79-87 (2006).
- Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
- Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).
- Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
- Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
- Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
- Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
- Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
- Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. “White coat compliance” limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
- Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
- Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
- Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
- Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
- Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
- Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
- Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).
- Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
- Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).
- Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
- Metcalfe, J. Z., O’Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).
