작은 모발 샘플에서 11가지 약물 내성 결핵 약물 정량화를 위한 LC-MS/MS 패널 검증
Summary
복잡한 약 저항하는 결핵 (DR-TB) 식이요법에 환자의 준수를 분석하는 현재 방법은 부정확하고 자원 집약적 일 수 있습니다. 우리의 방법은 11 DR-TB 약물의 농도에 대한 쉽게 수집하고 저장 매트릭스, 머리를 분석합니다. LC-MS/MS를 사용하여 약물 순임을 더 잘 이해하기 위해 활용할 수 있는 하위 나노그램 약물 수준을 결정할 수 있습니다.
Abstract
약물 내성 결핵(DR-TB)은 공중 보건 위협이 증가하고 있으며 치료 약물 수준의 평가는 중요한 임상적 이점을 가질 수 있습니다. 혈장 약 수준은 현재 금 표준 평가입니다, 그러나 phlebotomy 및 감기 사슬을 요구하고, 단지 아주 최근 준수를 붙잡습니다. 우리의 방법은 모발을 사용하여, 쉽게 수집하고 장기 준수의 반사 매트릭스, 11 항 결핵 약물을 테스트합니다. 우리 그룹에 의한 이전 작업은 모발의 항 레트로 바이러스 약물 수준이 HIV 결과와 관련이 있음을 보여줍니다. DR-TB 약물에 대한 우리의 방법은 2 mg의 모발 (뿌리근에 3cm 근위)을 사용하며, 이 모발은 분쇄되어 메탄올로 추출됩니다. 샘플은 단일 LC-MS/MS 방법으로 분석되어 16분 동안 11개의 약물을 정량화합니다. 11개의 약물에 대한 정량화(LLOQs)의 하한은 0.01 ng/mg에서 1 ng/mg에 이르는 범위입니다. 샘플은 약물의 면적 비를 사용하여 정량화되고, 15N-또는 13C 표지된 약물 동위 원소 폴로그. 우리는 0.001-100 ng/mg에 이르는 교정 곡선을 사용했습니다. 직접 관찰 된 치료 (DOT)에 DR-TB 환자로부터 수집 된 모발 샘플의 편의 샘플에 대한 방법의 적용은 11 개의 약물 중 9 개의 선형 동적 범위 내에서 모발의 약물 수준을 나타내고 있습니다 (이소니아지드, 피라진아미드, 에탐부톨, 라인졸리드, 레보플록사신, 목시플로이신, 클로파지민, 베아퀴린, 프리토만). 어떤 환자도 프로티오나미드에 없었고, 에티오나미드에 대한 측정된 수준은 LLOQ에 가까웠습니다(노출 모니터링을 위한 에티오아마이드 대사산물의 적합성을 조사하는 대신 추가 작업). 요약하면, 우리는 약물 내성 결핵 치료 중 치료 약물 모니터링을위한 기술로 머리에 DR-TB 약물에 대한 다중 타액 화 패널의 개발을 설명합니다.
Introduction
21 세기에, 약 저항하는 결핵 (DR-TB)는 이미 약한 국가 결핵 통제 프로그램에 대한 진화하는 재앙입니다, 확인된 케이스는 전 세계적으로 항균 저항과 관련있는 모든 죽음의 거의 1/3을 차지하는, 지난 5 년 에서만 두 배로,1,,2. DR-TB의 성공적인 치료는 약물 에 민감한 결핵에 대한 치료보다 전통적으로 더 길고 독성이 있는 2차 처방이 요구되고 있다. 더욱이, DR-TB를 가진 환자는 수시로 저항의 출현에 처음에 기여한 준수에 중요한 기존 도전이있습니다 3.
바이러스 성 부하가 처리를 감시하기 위하여 이용될 수 있는 HIV 감염과는 달리, 결핵에 있는 처리 반응의 대리 종점은 개별 수준4에연기되고 믿을 수 없습니다. 환자 준수를 모니터링, 하위 치료 항 결핵 약물 농도 및 치료 실패의 중요한 예측, 또한 도전이다. 자체보고 준수는 리콜 편견과공급자를기쁘게하는 욕망에서 고통5,6. 알약 수 및 약물 치료 이벤트 모니터링 시스템 (MEMS)은 더객관적일 수 있지만 실제 약물 소비를 측정하지 는 않지만8,,9,,10. 바이오 매트릭스의 약물 수준은 준수 및 약물 동력학 데이터를 모두 제공할 수 있습니다. 따라서, 혈장 약물 수준은 일반적으로 치료 약물 모니터링에 사용된다 11,,12. 그러나 약물 준수 모니터링의 맥락에서, 플라즈마 수준은 단기 노출을 나타내며 적절한 준수 기준 범위를 결정할 때 상당한 환자 간 가변성에 의해 제한됩니다. “백색 코트” 효과는, 클리닉 또는 연구 방문 전에 순도가 향상되는 데, 정확한 약물 준수 패턴을 제공하는 혈장 수준의 능력을 더욱 복잡하게 한다13.
모발은 장기간 약물 노출을 측정할 수 있는 대체바이오매트릭스(14,,15)이다. 많은 약물과 내인성 대사 산물은 모발이 성장함에 따라 전신 순환에서 모발 단백질 매트릭스에 통합됩니다. 이 역동적 인 과정이 모발 성장 중에 계속됨에 따라 모발 매트릭스에 증착 된 약물의 양은 순환약물의 지속적인 존재에 따라 달라지므로 모발은 약물 섭취의 훌륭한 시간적 판독입니다. 바이오매트릭스로서의 모발은 혈액에 비해 저장 및 선적을 위한 콜드 체인없이 쉽게 수집할 수 있다는 추가적인 이점이 있다. 또한, 모발은 비생체 위험성이며, 이는 현장에서 추가적인 타당성 이점을 제공한다.
모발 약물 수준은 법의학 응용 프로그램16에서오랫동안 사용되어 왔습니다. 지난 10 년 동안, 머리 antiretroviral (ARV) 수준은 HIV 치료 및 예방에 약물 준수를 평가에 유틸리티를 입증했다, 이는 우리의 그룹이 기여하는. 모발의 ARV,수준은 HIV 감염17,18,,19,20,,21에서치료 결과의 가장 강력한 독립적 인 예측 변수로 나타났다., DR-TB 환자의 모발 수치가 치료 결과를 예측하는 데 동일한 유용성을 가질 지 여부를 결정하기 위해 LC-MS/MS를 사용하여 작은 모발 샘플에서 11개의 DR-TB 약물을 분석하는 방법을 개발하고 검증했습니다. 분석의 성과의 초기 평가로, 우리는 남아프리카 공화국 웨스턴 케이프에 있는 직접 관찰한 치료 (DOT)를 수신하는 DR-TB를 가진 환자의 편의 표본에 있는 DR-TB 약 수준을 측정했습니다22.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 LC-MS/MS를 사용하여 작은 모발 샘플에서 DR-TB 치료에 활용된 11가지 항결핵 약물을 정량화하기 위해 개발하고 검증한 방법에 대한 프로토콜을 여기에서 보고합니다. 모발에 있는 이 11개의 약을 정량화하는 그밖 방법은 이전에 개발되고, 검증되고 간행되었습니다. 우리의 방법은 약 3 센티미터 (cm)의 약 20-30 머리 가닥에서 약물의 하위 나노 그램 수준을 정량화 할 수 있으며 이미…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 케이프 타운 폐 연구소의 대학에서 키에르탄 Dheda 교수, 알리 에스마일 박사, 마리에지 프레토리우스 에게 감사하고 싶습니다 연구를위한 모발 샘플의 수집을 촉진. 저자는 이 연구 참가자들의 기여를 더욱 감사하게 인정한다.
Materials
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
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