Validerad LC-MS/MS Panel för kvantifiering 11 läkemedelsresistenta tbc-läkemedel i små hårprover
Summary
Nuvarande metoder för att analysera patienternas anslutning till komplexa resistenta tuberkulos (DR-TB) regimer kan vara felaktiga och resurskrävande. Vår metod analyserar hår, en lättinsamlad och lagrad matris, för koncentrationer av 11 DR-TB mediciner. Med hjälp av LC-MS/MS, Vi kan bestämma sub-nanogram läkemedelsnivåer som kan användas för att bättre förstå läkemedelsuppföljsamhet.
Abstract
Läkemedelsresistent tuberkulos (DR-TB) är ett växande hot mot folkhälsan, och bedömning av terapeutiska läkemedelsnivåer kan ha viktiga kliniska fördelar. Plasma läkemedelsnivåer är den nuvarande guldmyntfoten bedömning, men kräver phlebotomy och en kall kedja, och fånga endast mycket nyligen följsamhet. Vår metod använder hår, en matris som är lätt samlas in och reflekterande av långsiktig följsamhet, för att testa för 11 anti-TB mediciner. Tidigare arbete av vår grupp visar att antiretrovirala läkemedelsnivåer i hår är förknippade med HIV-resultat. Vår metod för DR-TB läkemedel använder 2 mg hår (3 cm proximalt till roten), som pulveriseras och extraheras i metanol. Prover analyseras med en enda LC-MS/MS-metod, kvantifiera 11 läkemedel i en 16 min körning. Lägre kvantifieringsgränser (LLOQ) för de 11 läkemedlen varierar från 0,01 ng/mg till 1 ng/mg. Läkemedelsnärvaro bekräftas genom att jämföra förhållanden mellan två masspektrometriövergångar. Prover kvantifieras med hjälp av förhållandet mellan läkemedlet och dedematerade, 15N-, eller 13C-märkta läkemedel isotopolog. Vi använde en kalibreringskurva från 0.001-100 ng/mg. Tillämpning av metoden på ett bekvämlighetsprov av hårprover som samlats in från DR-TB-patienter på direkt observerad behandling (DOT) indikerade läkemedelsnivåer i hår inom det linjära dynamiska intervallet hos nio av de elva läkemedlen (isoniazid, pyrazinamid, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). Ingen patient var på protionionamid, och de uppmätta nivåerna för etionamid var nära dess LLOQ (med ytterligare arbete i stället undersöka lämpligheten av etionamid metabolit för övervakning exponering). Sammanfattningsvis beskriver vi utvecklingen av en multi-analyte panel för DR-TB läkemedel i hår som en teknik för terapeutiska läkemedelsövervakning under läkemedelsresistenta TB behandling.
Introduction
Under det tjugoförsta århundradet är läkemedelsresistent tuberkulos (DR-TB) en växande katastrof för redan svaga nationella tbc-kontrollprogram, med bekräftade fall som fördubblats bara under de senaste fem åren, och står för nästan en tredjedel av alla dödsfall relaterade till antimikrobiell resistens globalt1,2. Framgångsrik behandling av DR-TB har konventionellt krävs längre och mer giftiga andra linjens regimer än behandling för läkemedelskänsliga TB. Dessutom har patienter med DR-TB ofta betydande redan existerande utmaningar att följa, vilket bidrog till uppkomsten av resistens initialt3.
Till skillnad från HIV-infektion där virusbelastningar kan användas för att övervaka behandlingen, är surrogatslutpunkter för behandlingssvar i tbc fördröjd och otillförlitliga på individnivå4. Övervakning av patientens följsamhet, en viktig prediktor för subterapeutisk anti-TB läkemedelskoncentration och behandlingssvikt, är också utmanande. Självrapporterad följsamhet lider av återkallande partiskhet och önskan att behaga leverantörer5,6. Piller räknas och medicinering händelse övervakningssystem (MEMS) kan vara mer mål7 men inte mäta faktisk drogkonsumtion8,9,10. Läkemedelsnivåer i biomatrices kan ge både följsamhet och farmakokinetiska data. Därför används plasmaläkemedelsnivåer ofta i terapeutisk läkemedelsövervakning11,12. I samband med övervakning av läkemedelshämningen representerar dock plasmanivåer kortvarig exponering och begränsas av betydande variationer inom och mellan patienter vid fastställandet av lämpligt referensområde för följsamhet. “White coat” effekter, där följsamhet förbättras före kliniken eller studiebesök, ytterligare komplicerar förmågan hos plasmanivåer för att ge korrekt läkemedelshämning mönster13.
Hår är en alternativ biomatrix som kan mäta långvarig läkemedelsexponering14,15. Många läkemedel och endogena metaboliter införliva i håret protein matris från den systemiska cirkulationen som hår växer. Eftersom denna dynamiska process fortsätter under hårväxt, beror mängden läkemedel som deponeras i hårmatrisen på den kontinuerliga närvaron av läkemedlet i omlopp, vilket gör håret till en utmärkt tidsmässig avläsning av läkemedelsintag. Hår som biomatrix har den extra fördelen av att enkelt samlas in utan behov av kylkedja för förvaring och transport jämfört med blod. Dessutom är hår icke-biohazardous, vilket ger ytterligare genomförbarhetsfördelar på fältet.
Hår narkotikanivåer har länge använts i kriminaltekniska tillämpningar16. Under det senaste årtiondet, hår antiretrovirala (ARV) nivåer har visat nytta vid bedömningen av läkemedelshämning i HIV behandling och förebyggande, som vår grupp bidragit. ARV nivåer i hår har visat sig vara den starkaste oberoende prediktorer för behandlingsresultat i HIV-infektion17,18,19,20,21. För att avgöra om hårnivåer av DR-TB patienter kommer att ha samma nytta för att förutsäga behandling resultatet, vi använde LC-MS/MS för att utveckla och validera en metod för att analysera 11 DR-TB mediciner i små hårprover. Som en första bedömning av analysens prestanda mätte vi DR-TB-läkemedelsnivåer i ett bekvämlighetsprov av patienter med DR-TB som fick direkt observerad behandling (DOT) i Västra Kapprovinsen, Sydafrika22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi rapportera här protokollet för den metod vi utvecklat och validerat för att kvantifiera 11 anti-TB mediciner som används vid behandling av DR-TB i små hårprover med LC-MS/MS. Ingen annan metod för att kvantifiera dessa 11 läkemedel i hår har tidigare utvecklats, validerats och publicerats. Vår metod kan kvantifiera subnanogram nivåer av läkemedel i endast 20-30 hårstrån på cirka 3 centimeter (cm) i längd (~ 2 mg) och har redan validerats22. Den låga vikten av hårt analyseras i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka professor Keertan Dheda, Dr Ali Esmail, och Marietjie Pretorius vid University of Cape Town Lung Institute som underlättade insamling av hårprover för studien. Författarna erkänner vidare tacksamt bidragen från deltagarna i denna studie.
Materials
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
References
- Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
- Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
- Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, 79-87 (2006).
- Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
- Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).
- Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
- Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
- Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
- Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
- Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
- Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. “White coat compliance” limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
- Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
- Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
- Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
- Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
- Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
- Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
- Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).
- Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
- Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).
- Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
- Metcalfe, J. Z., O’Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).
