माउस एड्रेनल पर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग के लिए माइक्रोवाविंग और फ्लोरोफोर-टायरामाइड − एक ही मेजबान प्रजातियों से अनकॉन्जुज्ड प्राइमरी एंटीबॉडी का उपयोग करना
Summary
एक ही मेजबान प्रजातियों से प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग के लिए कई अलग-अलग तरीके स्थापित किए गए हैं। यहां, हम फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड माउस एड्रेनल सेक्शन पर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग के दौरान एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी को ब्लॉक करने के लिए माइक्रोवेव-मध्यस्थता एंटीबॉडी स्ट्रिपिंग और फ्लोरोफोर-टायरामाइड के उपयोग का वर्णन करते हैं।
Abstract
किसी दिए गए प्रोटीन के सेलुलर अभिव्यक्ति पैटर्न को दिखाने के लिए बायोमेडिकल रिसर्च में इम्यूनोस्टेनिंग का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग कई प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके लेबलिंग की अनुमति देता है। एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी को कम करने के लिए, अप्रत्यक्ष धुंधला का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग को विभिन्न मेजबान प्रजातियों से अलेबल प्राथमिक एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है। हालांकि, विभिन्न प्रजातियों एंटीबॉडी का उपयुक्त संयोजन हमेशा उपलब्ध नहीं होता है। यहां, हम एक ही मेजबान प्रजातियों (उदाहरण के लिए, इस मामले में दोनों एंटीबॉडी खरगोश से हैं) से अवेलेबल प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने की एक विधि का वर्णन करते हैं, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) माउस अधिवृक्क वर्गों पर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए। यह विधि पहले से दाग प्राथमिक एंटीबॉडी परिसर की गतिविधि को पट्टी करने के लिए एंटीजन पुनर्प्राप्ति चरण में उपयोग की जाने वाली एक ही प्रक्रिया और अभिकर्मकों का उपयोग करती है। स्लाइड एक सामान्य इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके पहले प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग थे जिसके बाद एक बायोटिनेटेड माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक बाध्यकारी कदम था। फिर, एक एविडिन-बायोटिन-पेरोक्सिडेस सिग्नल विकास विधि का उपयोग फ्लोरोफोर-टायरामाइड के साथ सब्सट्रेट के रूप में किया गया था। 8 मिन के लिए एक माइक्रोवेव उबलते सोडियम साइट्रेट समाधान में विसर्जन के माध्यम से पहले प्राथमिक एंटीबॉडी परिसर की इम्यूनोएक्टिविटी छीन ली गई थी। अघुलनशील फ्लोरोफोर-टायरामाइड जमाव नमूने पर बना रहा, जिसने स्लाइड को अन्य प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग दिया। हालांकि यह विधि सबसे झूठे सकारात्मक संकेतों को समाप्त करती है, एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी से कुछ पृष्ठभूमि बनी रह सकती है। यदि नमूनों को एंडोजेनस बायोटिन से समृद्ध किया जाता है, तो बरामद एंडोजेनस बायोटिन से झूठे सकारात्मक से बचने के लिए बायोटिनेटेड माध्यमिक एंटीबॉडी को बदलने के लिए एक पेरोक्सिड्स-कॉन्जुगेटेड सेकेंडरी एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है।
Introduction
मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग में, कंजुगेट प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके सीधे धुंधला करने से जानकारीपूर्ण परिणाम प्रदान किए जा सकते हैं। माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किए बिना, प्रत्यक्ष धुंधला विधि में एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी से झूठे कोस्थानीयकरण संकेतों का खतरा कम होता है। हालांकि, प्राथमिक एंटीबॉडी पर संयुग्मित रिपोर्टर्स (फ्लोरोफोर, एंजाइम) या बायोटिन अपने भविष्य के उपयोग को सीमित करते हैं। वैकल्पिक रूप से, अप्रत्यक्ष इम्यूनोस्टेनिंग आमतौर पर एक लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक अनकॉन्जुजेट प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके मजबूत संकेत प्रदान करता है। आदर्श रूप से, एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी से बचने के लिए मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग में उपयोग किए जाने वाले अनकॉन्जुजेड प्राथमिक एंटीबॉडी को विभिन्न मेजबान प्रजातियों से आना चाहिए। हालांकि, विभिन्न मेजबान प्रजातियों से प्राथमिक एंटीबॉडी का उचित संयोजन हमेशा उपलब्ध नहीं होता है।
एक अवांछित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया करने वाले माध्यमिक एंटीबॉडी के जोखिम को खत्म करने के लिए कई तरीके स्थापित किए गए हैं। एक आम विधि दूसरी प्राथमिक एंटीबॉडी1के साथ धुंधला करने से पहले पहले प्राथमिक एंटीबॉडी परिसर पर किसी भी शेष बाध्यकारी एपीटोप को ब्लॉक करने के लिए एफ (एबी) मोनोमेरिक एंटीबॉडी का उपयोग है। एंटीबॉडी स्ट्रिपिंग, जो एक पश्चिमी दाग पत्र की पट्टी और पुनर्जांच के समान है, 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)2 और फ्लोरोसेंट टायरामाइड जमाव3जैसे पता लगाने योग्य रिपोर्टर अणुओं के बयान को अलग किए बिना पहले दाग एंटीबॉडी परिसर को हटा देता है । इस विधि से अलग-अलग रंगों में रिपोर्टर अणु एक ही स्लाइड पर मल्टीप्लेक्स का रिजल्ट दिखा सकते हैं। मल्टीप्लेक्स धुंधला भी एंटीबॉडी की पहले से जमा की गई परतों को पूरी तरह से हटाने और अन्य एंटीबॉडी4,5से बाद में अधिग्रहीत छवियों के संरेखण से प्राप्त किया जा सकता है । ये विधियां सभी विश्वसनीय परिणाम देती हैं, हालांकि प्रत्येक विधि की अपनी सीमाएं होती हैं और या तो जटिल प्रक्रियाओं या एक विशेष इमेजिंग सिस्टम की आवश्यकता होती है।
वर्तमान प्रोटोकॉल आमतौर पर उपलब्ध बफ़र्स के उपयोग के साथ एंटीबॉडी स्ट्रिपिंग विधि के आवेदन को दर्शाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग एक ही मेजबान प्रजातियों से दो अलेबल प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) माउस अधिवृक्क वर्गों पर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला प्रदर्शन करने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग दो या दो से अधिक एंटीजन के सेलुलर कोस्थानीयकरण की जांच करने के लिए उपयोगी है। यह व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक कोस्थानीयकरण के परिणामों को समझाने देती है जब प्र?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच आर00 एचडी032636 द्वारा समर्थित किया जाता है।
Materials
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1000 dilution |
| Microwave oven, 700W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz, | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz, | SC-25269 | 1:1000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast, | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic, | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS, | NB300-109 | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam, | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
References
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