الميكروويف والفلوروفور- التيراميد للتلطيخ المناعي المتعدد على الغدة الكظرية للفأر - باستخدام الأجسام المضادة الأولية غير المُهمة من نفس الأنواع المضيفة
Summary
وقد تم وضع عدة طرق مختلفة لتلطيخ المناعة المتعددة باستخدام الأجسام المضادة الأولية من نفس الأنواع المضيفة. هنا ، نصف استخدام تجريد الأجسام المضادة بوساطة الميكروويف وفلوروفور -التياراميد لمنع تفاعل الأجسام المضادة أثناء تلطيخ المناعة المتعدد على أقسام الغدة الكظرية للفئران الثابتة من البارافين الثابتة.
Abstract
يستخدم تلطيخ المناعة على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية لإظهار نمط التعبير الخلوي لبروتين معين. يسمح تلطيخ المناعة المتعدد بالوسم باستخدام أجسام مضادة أولية متعددة. لتقليل التفاعل عبر الأجسام المضادة، يتطلب تلطيخ المناعة المتعدد باستخدام تلطيخ غير مباشر أجسامًا مضادة أولية غير محددة من أنواع مضيفة مختلفة. ومع ذلك ، فإن المزيج المناسب من الأجسام المضادة الأنواع المختلفة ليست متاحة دائما. هنا، نصف طريقة استخدام الأجسام المضادة الأولية غير المسماة من نفس الأنواع المضيفة (على سبيل المثال، في هذه الحالة كلا الأجسام المضادة هي من أرنب) لمثبطات المناعة المتعددة على الفورلين الثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ (FFPE) أقسام الأدرينالين الماوس. تستخدم هذه الطريقة نفس الإجراء والكواشف المستخدمة في خطوة استرجاع المستضد لتجريد نشاط مجمع الأجسام المضادة الأولية الملطخ سابقًا. كانت الشرائح ملطخة بالأجسام المضادة الأولية الأولى باستخدام بروتوكول تلطيخ مناعي عام متبوع بخطوة ملزمة بجسم مضاد ثانوي حيوي. ثم، تم استخدام طريقة تطوير إشارة avidin-biotin-peroxidase مع فلوروفور-تيراميد كركيزة. تم تجريد النشاط المناعي لأول مجمع الأجسام المضادة الأولية من خلال الغمر في محلول سيترات الصوديوم المغلي بالموجات الدقيقة لمدة 8 دقيقة. وبقي ترسب الفلوروفور-التيراميد غير القابل للذوبان على العينة، مما سمح بتلطيخ الشريحة بالأجسام المضادة الأولية الأخرى. على الرغم من أن هذا الأسلوب يلغي معظم الإشارات الإيجابية الكاذبة، قد تبقى بعض الخلفية من تفاعل الأجسام المضادة. إذا تم إثراء العينات بالبيوتين الذاتي، يمكن استخدام جسم ثانوي مترافق مع البيروكسيديز ليحل محل الجسم المضاد الثانوي الحيوي لتجنب الإيجابية الكاذبة من البيوتين الذاتي ة المنتفية.
Introduction
في التلطخ المناعي المتعدد، يمكن أن يوفر تلطيخ مباشر باستخدام الأجسام المضادة الأولية المترافقة نتائج مفيدة. دون استخدام الأجسام المضادة الثانوية، وطريقة تلطيخ المباشر لديه خطر منخفض من إشارات توطين كاذبة من التفاعل عبر الأجسام المضادة. ومع ذلك ، فإن المراسلين المترافقين (الفلوروفور ، الإنزيمات) أو البيوتين على الأجسام المضادة الأولية يحدون من استخدامه في المستقبل. بدلاً من ذلك، عادة ما يوفر تلطيخ المناعة غير المباشر إشارات أقوى باستخدام جسم مضاد أولي غير مُجرَّد بجسم مضاد ثانوي مُلصق. من الناحية المثالية ، يجب أن تأتي الأجسام المضادة الأولية غير المنقطعة المنتية المستخدمة في تلطيخ المناعة المتعدد من أنواع مضيفة مختلفة لتجنب تفاعل الأجسام المضادة. ومع ذلك ، فإن المزيج المناسب من الأجسام المضادة الأولية من الأنواع المضيفة المختلفة غير متاح دائمًا.
وقد وضعت عدة طرق للقضاء على خطر الجسم المضاد الثانوي تتفاعل مع الأجسام المضادة الأولية غير المرغوب فيها. طريقة واحدة شائعة هي استخدام الأجسام المضادة أحادية F (ab) لمنع أي epitopes ملزمة المتبقية على أول مجمع الأجسام المضادة الأولية قبل تلطيخ مع الأجسام المضادة الأولية الثانية1. تجريد الأجسام المضادة ، والتي تشبه الشريط وإعادة سبر من ورقة لطخة الغربية ، يزيل مجمع الأجسام المضادة الملطخة سابقا دون تجريد ترسب جزيئات المراسل ة القابلة للكشف مثل 3،3’diaminobenzidine رباعي هيدروكلوريد (DAB)2 وترسب التيراميد الفلورسنت3. مع هذه الطريقة، يمكن أن تظهر جزيئات المراسل بألوان مختلفة نتيجة متعددة على نفس الشريحة. يمكن أيضًا تحقيق تلطيخ تعدد الأجسام من خلال الإزالة الكاملة للطبقات المودعة سابقًا من الأجسام المضادة ومحاذاة الصور التي تم الحصول عليها لاحقًا من الأجسام المضادة الأخرى4،5. هذه الأساليب تعطي جميع نتائج موثوق بها، على الرغم من أن كل طريقة لها حدودها وتتطلب إما إجراءات معقدة أو نظام تصوير خاص.
يُظهر البروتوكول الحالي تطبيق طريقة تجريد الأجسام المضادة باستخدام المخازن المؤقتة المتاحة بشكل شائع. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإجراء تلطيخ الفلورسنت المناعي المتعدد على أقسام الغدة الكظرية للفأرة (FFPE) الثابتة البارافين (FFPE) مع اثنين من الأجسام المضادة الأولية غير المسماة من نفس النوع المضيف.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد التلطخ المناعي المتعدد مفيدًا لفحص التوطين الخلوي لمستضدين أو أكثر. هذه التقنية المستخدمة على نطاق واسع تعطي نتائج مقنعة للتوطين عندما تكون الأجسام المضادة الأولية مترافقة مع مراسلين مختلفين (تلطيخ مباشر). ومع ذلك ، فإن تلطيخ مباشر عادة ما يوفر إشارات أضعف مقارنة بتلطيخ غير مباشر ، وا…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R00 HD032636.
Materials
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1000 dilution |
| Microwave oven, 700W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz, | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz, | SC-25269 | 1:1000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast, | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic, | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS, | NB300-109 | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam, | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
References
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
- Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
- Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
- Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
- Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
- Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).
