Mikrowaving og fluorophore-tyramid for multipleks immunbeising på mus binyrene − Ved hjelp av unconjugert primære antistoffer fra samme vertsarter
Summary
Flere ulike metoder er etablert for multipleks immunstaining ved hjelp av primære antistoffer fra samme vertsarter. Her beskriver vi bruken av mikrobølgemediert antistoffstripping og fluorophore-tyramid for å blokkere antistoffkryssreaktivitet under multipleks immunstaining på formalin-fast parafin-innebygde musbinyreseksjoner.
Abstract
Immunfarging er mye brukt i biomedisinsk forskning for å vise det cellulære uttrykksmønsteret til et gitt protein. Multiplex immunstaining gjør det mulig å merke ved hjelp av flere primære antistoffer. For å minimere antistoffkryssreaktivitet krever multipleks immunbeising ved hjelp av indirekte farging umerkede primære antistoffer fra forskjellige vertsarter. Den riktige kombinasjonen av forskjellige arter antistoffer er imidlertid ikke alltid tilgjengelig. Her beskriver vi en metode for bruk av umerkede primære antistoffer fra samme vertsart (f.eks. i dette tilfellet er begge antistoffene fra kanin) for multipleksimmunofluorescens på formalin-fast parafininnebygd (FFPE) musbinyreseksjoner. Denne metoden bruker samme prosedyre og reagenser som brukes i antigengjenfinningstrinnet for å fjerne aktiviteten til det tidligere fargede primære antistoffkomplekset. Lysbildene ble farget med det første primære antistoffet ved hjelp av en generell immunstainingprotokoll etterfulgt av et bindende trinn med et biotinylated sekundært antistoff. Deretter ble en avidin-biotin-peroxidase signalutviklingsmetode brukt med fluorophore-tyramid som substrat. Immunaktiviteten til det første primære antistoffkomplekset ble strippet gjennom nedsenking i en mikrobølgekokende natriumsitratløsning i 8 min. Den uoppløselige fluorophore-tyramiddeponen forble på prøven, noe som gjorde at lysbildet kunne være farget med andre primære antistoffer. Selv om denne metoden eliminerer de fleste falske positive signaler, kan det hende at noen bakgrunn fra antistoffkryssreaktivitet kan forbli. Hvis prøvene er beriket med endogene biotin, kan et peroksidase-konjugert sekundært antistoff brukes til å erstatte det biotinylated sekundære antistoffet for å unngå falsk positiv fra gjenvunnet endogen biotin.
Introduction
I multix immunbeising kan direkte farging ved hjelp av konjugerte primære antistoffer gi informative resultater. Uten å bruke sekundære antistoffer har den direkte fargingsmetoden lav risiko for falske kolokaliseringssignaler fra antistoffkryssreaktivitet. Imidlertid begrenser de konjugerte journalistene (fluorophore, enzymer) eller biotin på det primære antistoffet sin fremtidige bruk. Alternativt gir indirekte immunstaining vanligvis sterkere signaler ved å bruke et ukonjugert primærantistoff med et merket sekundært antistoff. Ideelt sett bør ukonjugerte primære antistoffer som brukes i multipleks immunstaining komme fra forskjellige vertsarter for å unngå antistoffkryssreaktivitet. Den riktige kombinasjonen av primære antistoffer fra forskjellige vertsarter er imidlertid ikke alltid tilgjengelig.
Flere metoder er etablert for å eliminere risikoen for at det sekundære antistoffet reagerer med et uønsket primærantistoff. En vanlig metode er bruk av et F(ab) monomeriske antistoff for å blokkere eventuelle gjenværende bindende epitoper på det første primære antistoffkomplekset før farging med det andre primære antistoffet1. Antistoffstripping, som ligner på stripen og reprobeav et vestlig flekkark, fjerner det tidligere fargede antistoffkomplekset uten å fjerne avsetning av påviselige reportermolekyler som 3,3′-diaminobenzidin tetrahydrochloride (DAB)2 og fluorescerende tyramiddeponering3. Med denne metoden kan reportermolekyler i forskjellige farger vise et multipleksresultat på samme lysbilde. Multipleksfarering kan også oppnås ved fullstendig fjerning av de tidligere deponerte lagene av antistoffer og justeringen av senere oppkjøpte bilder fra andre antistoffer4,5. Disse metodene gir alle pålitelige resultater, selv om hver metode har sine begrensninger og krever enten kompliserte prosedyrer eller et spesielt bildesystem.
Den nåværende protokollen viser anvendelsen av en antistoffstrippingsmetode ved bruk av allment tilgjengelige buffere. Denne protokollen kan brukes til å utføre multipleks immunofluorescerende farging på formalin-fast parafin-innebygd (FFPE) mus binyreseksjoner med to umerkede primære antistoffer fra samme vertsart.
Protocol
Representative Results
Discussion
Multipleks immunstaining er nyttig for å undersøke cellulær kolokalisering av to eller flere antigener. Denne mye brukte teknikken gir overbevisende kolokaliseringsresultater når primære antistoffer konjugeres med forskjellige journalister (direkte farging). Imidlertid gir direkte farging vanligvis svakere signaler sammenlignet med indirekte flekker, noe som innebærer konjugerte sekundære antistoffer for å oppdage de primære antistoffene. I indirekte farging er et multiloksimmunostainingsresultat av høy kvalite…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet støttes av NIH R00 HD032636.
Materials
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1000 dilution |
| Microwave oven, 700W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz, | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz, | SC-25269 | 1:1000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast, | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic, | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS, | NB300-109 | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam, | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
References
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
- Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
- Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
- Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
- Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
- Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).
