Micro-ondes et Fluorophore-Tyramide pour l’immunostaining multiplex sur les surrénales de souris - utilisation d’anticorps primaires non conjugués de la même espèce hôte

Résumé

Plusieurs méthodes différentes ont été établies pour l’immunostaining multiplex utilisant des anticorps primaires de la même espèce hôte. Ici, nous décrivons l’utilisation du décapage micro-ondes d’anticorps et du fluorophore-tyramide pour bloquer la réactivité croisée d’anticorps pendant l’immunostaining multiplex sur les sections surrénales paraffines formalin-fixes de paraffine.

Résumé

Immunostaining est largement utilisé dans la recherche biomédicale pour montrer le modèle d’expression cellulaire d’une protéine donnée. L’immunostaining multiplex permet l’étiquetage à l’aide de plusieurs anticorps primaires. Pour minimiser la réactivité croisée des anticorps, l’immunostaining multiplex à l’aide de taches indirectes nécessite des anticorps primaires non étiquetés provenant de différentes espèces hôtes. Cependant, la combinaison appropriée de différents anticorps d’espèces n’est pas toujours disponible. Ici, nous décrivons une méthode d’utilisation des anticorps primaires non étiquetés de la même espèce hôte (par exemple, dans ce cas, les deux anticorps sont du lapin) pour l’immunofluorescence multiplex sur les sections surrénales de souris formalin-fixes (FFPE). Cette méthode utilise la même procédure et les réactifs utilisés dans l’étape de récupération d’antigène pour dépouiller l’activité du complexe d’anticorps primaire précédemment taché. Des glissières ont été souillées avec le premier anticorps primaire utilisant un protocole d’immunostaining général suivi d’une étape de liaison avec un anticorps secondaire biotinylated. Ensuite, une méthode de développement de signal avidin-biotine-peroxidase a été utilisée avec le fluorophore-tyramide comme substrat. L’immunoactivité du premier complexe primaire d’anticorps a été dépouillée par immersion dans une solution de citrate de sodium bouillante au micro-ondes pendant 8 min. Le dépôt insoluble de fluorophore-tyramide est resté sur l’échantillon, ce qui a permis à la glissière d’être tachée avec d’autres anticorps primaires. Bien que cette méthode élimine la plupart des faux signaux positifs, un certain fond de la réactivité croisée des anticorps peut rester. Si les échantillons sont enrichis en biotine endogène, un anticorps secondaire conjugué par peroxidase peut être utilisé pour remplacer l’anticorps secondaire biotinylated pour éviter le faux positif de la biotine endogène récupérée.

Introduction

Dans l’immunostaining multiplex, la coloration directe utilisant des anticorps primaires conjugués peut fournir des résultats informatifs. Sans utiliser d’anticorps secondaires, la méthode de coloration directe présente un faible risque de faux signaux de colocalisation provenant de la réactivité croisée des anticorps. Cependant, les reporters conjugués (fluorophore, enzymes) ou la biotine sur l’anticorps primaire limitent son utilisation future. Alternativement, l’immunostaining indirect fournit habituellement des signaux plus forts en utilisant un anticorps primaire non conjugué avec un anticorps secondaire étiqueté. Idéalement, les anticorps primaires non conjugués....

Protocole

1. Staining avec le premier anticorps

1. Décire et réhydrater les glissières FFPE avec 5 min allouées à chacune des étapes suivantes : xylène ou réactifs équivalents 3x, 100 % éthanol 2x, 95 % éthanol 1x, 70 % éthanol 1x, 50 % éthanol 1x et eau distillée 2x.
   REMARQUE : Les glissières doivent rester humides à partir de cette étape de réhydratation jusqu’à l’accumulation dans l’étape finale.
2. Pour la récupération facultative de l’antigène, placez les lames dans 275 ml de solution de citrate de sodium bouillante (10 mm, pH et 6,0) pendant 8 min. Pour maintenir la solution bouillante, placez les lames à plat sur le fond d’une boîte de tuyauterie de 14 x....

Résultats

Les résultats ont été obtenus à partir d’échantillons traités avec toutes les étapes décrites, y compris l’étape de récupération d’antigène 1.2. Tous les anticorps secondaires utilisés ici ont été biotinylated. Fluorophore-tyramide a été utilisé pour développer des signaux à partir des premiers et deuxièmes anticorps primaires. Des images ont été capturées à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un cube FITC (pour la fluorescence verte), d’un cube TxRED (pour Cy3) et d’un cube DA.......

Discussion

Multiplex immunostaining est utile pour examiner la colocalisation cellulaire de deux ou plusieurs antigènes. Cette technique largement utilisée donne des résultats convaincants de colocalisation lorsque les anticorps primaires sont conjugués avec différents journalistes (coloration directe). Cependant, la coloration directe fournit habituellement des signaux plus faibles par rapport à la coloration indirecte, ce qui implique des anticorps secondaires conjugués pour détecter les anticorps primaires. Dans la coloration in.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Âne biotinylé anti-souris	JacksonImmuno	715-066-151	dilution 1:500
âne biotinylé anti-lapin	JacksonImmuno	711-066-152	dilution 1:500
DAPI	BioLegend	422801	2 &mu ; g/mL dans de l’eau distillée
Microscope à fluorescence	ECHO	Revolve 4
Raifort streptavidine conjuguée à la peroxydase	JacksonImmuno	016-030-084	Dilution 1:1 000
Four à micro-ondes, 700 W	General Electric	JEM3072DH1BB
Souris anti-CYP2F2	Santa Cruz	SC-374540	dilution 1:250
Souris anti-TH	Santa Cruz	SC-25269	dilution 1:1 000
Sérum d’âne normal	JacksonImmuno	017-000-121	Sérum à 2 % dans PBST
Lapin anti-20&alpha ; HSD	Kerafast	EB4002	dilution 1:500
Lapin anti-3&beta ; HSD	TransGenic	KO607	dilution 1:250
Rabbit anti-TH	NOVUS	NB300-109	dilution 1:1 000
Rabbit anti-&beta ;-catenin	Abcam	ab32572	dilution 1:500
Streptavidin Raifort Peroxydase (SA-HRP)	JacksonImmuno	016-303-084	Dilution 1:1 000
TSA Cy3 Tyramide	PerkinElmer	SAT704B001EA	Dilution de 1:100
TSA Fluorescéine Tyramide	PerkinElmer	SAT701001EA	dilution 1:100