Микроволновая печь и флурофор-тирамид для мультиплексиммунов на мышонке надпочечников - Использование неконъюгированных первичных антител из тех же видов хост
Summary
Было установлено несколько различных методов мультиплексного иммуностоинга с использованием первичных антител одного и того же вида хозяев. Здесь мы описываем использование микроволновой опосредованной антитела зачистки и фторофора-тирамид блокировать антитела поперечной реактивности во время мультиплексиммуностина на формалин фиксированной парафин-встроенных мыши надпочечников разделов.
Abstract
Иммуностоинг широко используется в биомедицинских исследованиях, чтобы показать клеточное выражение картины данного белка. Мультиплекс иммуностоидает позволяет маркировки с использованием нескольких первичных антител. Чтобы свести к минимуму кросс-реактивность антител, мультиплекс иммуномаркировки с использованием косвенного окрашивания требует немаркированных первичных антител от различных видов хозяина. Однако, соответствующее сочетание различных видов антител не всегда доступна. Здесь мы описываем метод использования немаркированных первичных антител из тех же видов хозяев (например, в данном случае оба антитела от кролика) для мультиплекса иммунофлуоресценции на формалино-фиксированной парафин-встроенных (FFPE) мыши надпочечников разделов. Этот метод использует ту же процедуру и реагенты, используемые в шаге поиска антигена, чтобы лишить активность ранее окрашенных первичного комплекса антител. Слайды были окрашены первым первичным антителом с использованием общего протокола иммуностоинга с последующим связывающим шагом с биотинилатированным вторичным антителом. Затем в качестве субстрата использовался метод развития сигнала авидин-биотин-пероксидаза. Иммуноактивность первого первичного комплекса антител была снята путем погружения в микроволновой кипящей цитрат натрия раствор в течение 8 минут. Нерастворимый фторофор-тирамид осаждения остались на образце, что позволило слайд быть окрашены с другими первичными антителами. Хотя этот метод устраняет большинство ложных положительных сигналов, некоторый фон от перекрестной реактивности антител может остаться. Если образцы обогащены эндогенным биотином, пероксидаза-конъюгированных вторичных антител может быть использована для замены биотинилаповых вторичных антител, чтобы избежать ложного срабатывания от восстановленного эндогенного биотина.
Introduction
В мультиплексе иммуносточинов, прямое окрашивание с использованием конъюгированных первичных антител может обеспечить информативные результаты. Без использования вторичных антител, метод прямого окрашивания имеет низкий риск ложных сигналов колокализации от перекрестной реактивности антител. Однако конъюгированные репортеры (фторофор, ферменты) или биотин на первичном антителе ограничивают его использование в будущем. Кроме того, косвенное иммуностоирование обычно обеспечивает более сильные сигналы с помощью неконъюгированных первичных антител с помеченными вторичными антителами. В идеале, неконъюгированные первичные антитела, используемые в мультиплексном иммуностонинге, должны поступать от различных видов хозяев, чтобы избежать перекрестной реактивности антител. Однако, соответствующее сочетание первичных антител от различных видов хозяина не всегда доступны.
Было установлено несколько методов для устранения риска реакции вторичных антител нежелательным первичным антителом. Одним из распространенных методов является использование мономерных антител F (AB) для блокирования любых оставшихся связывающих эпитопов на первом первичном комплексе антител перед окрашиванием второго первичного антитела1. Зачистка антител, которая похожа на полосу и повторное исследование западного листа побот, удаляет ранее окрашенные антитела комплекса без зачистки осаждения обнаруживаемых молекул репортера, таких как 3,3′-диаминобензидин тетрагидрохлорид (DAB)2 и флуоресцентные тирамида осаждения3. С помощью этого метода молекулы репортера в разных цветах могут показывать результат мультиплекса на одном слайде. Мультиплексок окрашивания также достижимо путем полного удаления ранее отложенных слоев антител и выравнивание впоследствии приобретенных изображений из других антител4,5. Все эти методы дают надежные результаты, хотя каждый метод имеет свои ограничения и требует либо сложных процедур, либо специальной системы визуализации.
Настоящий протокол показывает применение метода зачистки антител с использованием широко доступных буферов. Этот протокол может быть использован для выполнения мультиплекс иммунофторных окрашивания на формалина фиксированной парафин-встроенных (FFPE) мыши надпочечников разделы с двумя немаркированных первичных антител из тех же видов хозяина.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мультиплекс иммуностоинг полезно для изучения клеточной колокализации двух или более антигенов. Этот широко используемый метод дает убедительные результаты colocalization когда главным образом антитела спрягиваются с по-разному репортерами (сразу окрашивание). Тем не менее, прямое окрашив?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается NIH R00 HD032636.
Materials
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1000 dilution |
| Microwave oven, 700W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz, | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz, | SC-25269 | 1:1000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast, | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic, | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS, | NB300-109 | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam, | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
References
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
- Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
- Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
- Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
- Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
- Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).
