Microwaving och fluorofforerare-tyramid för Multiplex Immunstaining på Mus Adrenals − Använda okonjugerade primära antikroppar från samma värdarter
Summary
Flera olika metoder har fastställts för multiplex immunfärgning med hjälp av primära antikroppar från samma värdarter. Här beskriver vi användningen av mikrovågsmedierad antikroppsstrippning och fluoroffors-tyramid för att blockera antikroppskorsåteraktivitet under multiplex immunfärgning på formalin-fast paraffin-inbäddade musadrenal sektioner.
Abstract
Immunostaining används ofta i biomedicinsk forskning för att visa cellulärt uttryckmönster av ett visst protein. Multiplex immunfärgning tillåter märkning med hjälp av flera primära antikroppar. För att minimera antikroppskorsreaktivitet kräver multiplex immunfärgning med indirekt färgning omärkta primära antikroppar från olika värdarter. En lämplig kombination av olika arter finns dock inte alltid tillgänglig. Här beskriver vi en metod för att använda omärkta primära antikroppar från samma värdarter (t.ex. i detta fall är båda antikropparna från kanin) för multiplex immunfluorescens på formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) mus adrenal sektioner. Denna metod använder samma procedur och reagenser som används i antigenhämtningssteget för att skala aktiviteten hos det tidigare färgade primära antikroppskomplexet. Diabilder färgades med den första primära antikroppen med hjälp av en allmän immunfärgning protokoll följt av ett bindande steg med en biotinylated sekundär antikropp. Sedan användes en avidin-biotin-peroxidassignalutvecklingsmetod med fluoroffors-tyramid som substratet. Immunaktiviteten hos det första primära antikroppskomplexet togs bort genom nedsänkning i en mikrovågskokande natriumcitratlösning i 8 min. Den olösliga fluoroffors-tyramid nedfall kvar på provet, vilket gjorde att bilden kunde färgas med andra primära antikroppar. Även om denna metod eliminerar de flesta falska positiva signaler, kan viss bakgrund från antikroppskorsreaktivitet finnas kvar. Om proverna är berikade med endogen biotin kan en peroxidaskonjurat sekundär antikropp användas för att ersätta den biotinylated sekundära antikroppen för att undvika falskt positivt från återvunnen endogen biotin.
Introduction
Vid multiplex immunfärgning, direkt färgning med konjugerat primära antikroppar kan ge informativa resultat. Utan att använda sekundära antikroppar har den direkta färgningsmetoden en låg risk för falska samtidighetssignaler från antikroppskorsreaktivitet. Emellertid, de konjugerade reportrar (fluoroffor, enzymer) eller biotin på den primära antikroppen begränsa dess framtida användning. Alternativt ger indirekt immunfärgning vanligtvis starkare signaler genom att använda en okonjugerade primära antikroppar med en märkt sekundär antikropp. Helst bör okonjugerade primära antikroppar som används i multiplex immunfärgning komma från olika värdarter för att undvika antikroppskorsreaktivitet. En lämplig kombination av primära antikroppar från olika värdarter är dock inte alltid tillgänglig.
Flera metoder har fastställts för att eliminera risken för att den sekundära antikroppen reagerar med en oönskad primär antikropp. En vanlig metod är användningen av en F(ab) monomeric antikroppar för att blockera eventuella återstående bindande epitoper på den första primära antikroppar komplex innan färgning med den andra primära antibody1. Antibody strippning, som liknar remsan och reprobe av en västerländsk blot blad, tar bort tidigare färgade antikroppar komplex utan att strippa nedfallet av detekterbara reporter molekyler såsom 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)2 och fluorescerande tyramid nedfall3. Med denna metod kan reportermolekyler i olika färger visa ett multiplexresultat på samma bild. Multiplex färgning kan också uppnås genom fullständig borttagning av tidigare deponerade lager av antikroppar och anpassningen av senare förvärvade bilder från andra antikroppar4,5. Dessa metoder ger alla tillförlitliga resultat, även om varje metod har sina begränsningar och kräver antingen komplicerade förfaranden eller ett särskilt bildsystem.
Det aktuella protokollet visar tillämpningen av en antikroppsstrippningsmetod med användning av allmänt tillgängliga buffertar. Detta protokoll kan användas för att utföra multiplex immunfluorescerande färgning på formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) mus adrenal sektioner med två omärkta primära antikroppar från samma värdarter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Multiplex immunfärgning är användbart för att undersöka cellulär colocalization av två eller flera antigener. Denna allmänt använda teknik ger övertygande colocalization resultat när primära antikroppar är konjugerat med olika reportrar (direkt färgning). Direktfärgning ger dock vanligtvis svagare signaler jämfört med indirekt färgning, vilket innebär konjugerade sekundära antikroppar för att upptäcka de primära antikropparna. Vid indirekt färgning, en högkvalitativ multiplex immunfärgning resul…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH R00 HD032636.
Materials
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1000 dilution |
| Microwave oven, 700W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz, | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz, | SC-25269 | 1:1000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast, | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic, | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS, | NB300-109 | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam, | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
References
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
- Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
- Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
- Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
- Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
- Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).
