Fare Adrenallerinde Çokkatlı İmmünoboyama için Mikrowaving ve Florosofor-Tyramide - Aynı Konak Türlerinden Konjuge Olmayan Birincil Antikorların Kullanılması
Summary
Aynı konak türün primer antikorları kullanılarak multipleks immünboyama için çeşitli yöntemler oluşturulmuştur. Burada, formalin-sabit parafin gömülü fare adrenal bölümlerinde multipleks immünboyama sırasında antikor çapraz reaktivitesini engellemek için mikrodalga aracılı antikor sıyırma ve florofor-tiramid kullanımını açıklıyoruz.
Abstract
Immunostaining yaygın olarak belirli bir proteinin hücresel ifade deseni göstermek için biyomedikal araştırmalarda kullanılır. Multipleks immünboyama birden fazla primer antikor kullanarak etiketleme sağlar. Antikor çapraz reaktivitesini en aza indirmek için, dolaylı boyama kullanarak multipleks immünboyama farklı konak türlerinden etiketsiz birincil antikorlar gerektirir. Ancak, farklı tür antikorlarının uygun kombinasyonu her zaman mevcut değildir. Burada, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) fare adrenal kesitlerinde multipleks immünofluoresans için aynı konak türlerden (örneğin, bu durumda her iki antikor da tavşandan) etiketlenmemiş birincil antikorların kullanılması nın bir yöntemini tanımlıyoruz. Bu yöntem, daha önce lekelenmiş primer antikor kompleksinin aktivitesini siliklemek için antijen alma adımında kullanılan aynı prosedürü ve reaktifleri kullanır. Slaytlar genel bir immünboyama protokolü kullanılarak ilk primer antikor ile boyandı ve ardından biyotinylated sekonder antikor ile bağlayıcı bir adım atıldı. Daha sonra, bir avidin-biotin-peroksidaz sinyal geliştirme yöntemi substrat olarak florofor-tiramid ile kullanılmıştır. İlk primer antikor kompleksinin immünaktivitesi mikrodalgada kaynayan sodyum sitrat çözeltisi ile 8 dakika boyunca daldırma yoluyla çıkarıldı. Çözünmez florofor-tiramid birikimi, slayt diğer primer antikorlar ile lekeli izin örnek üzerinde kaldı. Bu yöntem çoğu yanlış pozitif sinyalleri ortadan kaldırsa da, antikor çapraz reaktivite bazı arka plan kalabilir. Örnekler endojen biotin ile zenginleştirilmiş ise, bir peroksidaz konjuge sekonder antikor kurtarılan endojen biotin yanlış pozitif önlemek için biyotinylated ikincil antikor yerine kullanılabilir.
Introduction
Multipleks immünboyama, konjuge primer antikorlar kullanılarak doğrudan boyama bilgilendirici sonuçlar sağlayabilir. Sekonder antikorlar kullanmadan, doğrudan boyama yöntemi antikor çapraz reaktivite yanlış kolokalizasyon sinyalleri düşük bir risk vardır. Ancak, konjuge muhabirler (florofor, enzimler) veya primer antikor üzerinde biotin gelecekteki kullanımını sınırlamak. Alternatif olarak, dolaylı immünboyama genellikle etiketli ikincil antikor ile konjuge olmayan bir primer antikor kullanarak güçlü sinyaller sağlar. İdeal olarak, multipleks immünboyama kullanılan konjuge olmayan primer antikorlar antikor çapraz reaktivite önlemek için farklı konak türlerden gelmelidir. Ancak, farklı konak türlerden birincil antikorların uygun kombinasyonu her zaman mevcut değildir.
İstenmeyen bir primer antikorile tepki gösteren sekonder antikor riskini ortadan kaldırmak için çeşitli yöntemler oluşturulmuştur. Yaygın yöntemlerden biri, ikinci primer antikor1ile boyama dan önce ilk primer antikor kompleksinde kalan bağlayıcı epitopları engellemek için F(ab) monomerik antikor kullanımıdır. Batı leke tabakasının şerit ve reprobuna benzeyen antikor sıyırma, 3,3′-diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB)2 ve floresan tiramidbirikimi3 gibi saptanabilir muhabir moleküllerin birikimini sıyırma olmadan daha önce lekeli antikor kompleksini kaldırır. Bu yöntemle, farklı renklerdeki muhabir moleküller aynı slaytta çok katlı bir sonuç gösterebilir. Multipleks boyama da antikorların daha önce birikmiş katmanları nın tamamen kaldırılması ve diğer antikorlardan sonradan edinilen görüntülerin hizalanması ile elde edilebilir4,5. Her yöntemin kendi sınırlamaları olmasına ve karmaşık prosedürler veya özel bir görüntüleme sistemi gerektirmesine rağmen, bu yöntemlerin tümü güvenilir sonuçlar verir.
Bu protokol, yaygın olarak kullanılan arabelleklerin kullanımı yla birlikte bir antikor sıyırma yönteminin uygulanmasını gösterir. Bu protokol, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) fare adrenal kesitlerinde aynı konak türden iki etiketsiz birincil antikor içeren çok katlı immünoresan boyama yapmak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Multipleks immünboyama iki veya daha fazla antijenin hücresel kolokalizasyonunu incelemek için yararlıdır. Yaygın olarak kullanılan bu teknik, primer antikorlar farklı muhabirlerle konjuge edildiğinde (doğrudan boyama) ikna edici kolokalizasyon sonuçları verir. Ancak, doğrudan boyama genellikle birincil antikorları tespit etmek için konjuge ikincil antikorlar içeren dolaylı boyama ile karşılaştırıldığında zayıf sinyaller sağlar. Dolaylı boyamada, yüksek kaliteli multipleks immünboyama sonucu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH R00 HD00 HD032636 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1000 dilution |
| Microwave oven, 700W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz, | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz, | SC-25269 | 1:1000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast, | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic, | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS, | NB300-109 | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam, | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
References
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
- Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
- Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
- Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
- Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
- Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).
