Förbättrad livskraft för Ex vivo 3D Hydrogel Kulturer av patient-derived Xenografts i en Perfused mikrofluidisk plattform
Summary
Detta protokoll demonstrerar metoder för att möjliggöra utökad in vitro-kultur av patient-härledda xenografts (PDX). Ett steg förstärker den totala livskraften hos flercelliga klusterkulturer i 3D-hydrogeler, genom okomplicerat avlägsnande av icke-livskraftiga enstaka celler. Ett sekundärt steg visar bästa praxis för PDX-kultur i en perfused mikrofluidisk plattform.
Abstract
Patient-härledda xenografts (PDX), som genereras när resected patienten tumör vävnad är engrafted direkt i immunkomprometterade möss, förbli biologiskt stabil, därigenom bevara molekylära, genetiska och histologiska funktioner, samt heterogenitet ursprungliga tumör. Men med hjälp av dessa modeller för att utföra en mängd experiment, inklusive drogscreening, är oöverkomliga både när det gäller kostnad och tid. Tredimensionella (3D) kultursystem ses allmänt som plattformar där cancerceller behåller sin biologiska integritet genom biokemiska interaktioner, morfologi och arkitektur. Vårt team har lång erfarenhet av att kultföra PDX-celler in vitro med hjälp av 3D-matriser som består av hyaluronsyra (HA). För att separera musfibroblast stromal celler i samband med PDXs, använder vi rotationskultur, där stromal celler följer ytan av vävnad kultur-behandlade plattor medan dissociated PDX tumörceller flyta och själv-associera i flercelliga kluster. Också flytande i supernatanten är singel, ofta döda celler, som presenterar en utmaning, i att samla in livsdugliga PDX-klungor för downstream inkapsling in hydrogels för 3D-cellkultur. För att skilja dessa enstaka celler från levande cell kluster, har vi anställd densitet steg gradient centrifugation. Det protokoll som beskrivs här möjliggör utarmning av icke-livskraftiga enstaka celler från den friska populationen av cellkluster som kommer att användas för ytterligare in vitro-experiment. I våra studier införlivar vi 3D-kulturerna i mikrofluidiska plattor som möjliggör mediaperfusion under kulturen. Efter att ha bedömt de resulterande kulturerna med hjälp av en fluorescerande bild-baserade viability assay av renas kontra icke-renas celler, våra resultat visar att denna ytterligare separation steg avsevärt minskat antalet icke-livskraftiga celler från våra kulturer.
Introduction
Under det senaste årtiondet har området cancerforskning visat förnyad entusiasm för patient-derived xenografts (PDXs) som ett verktyg för att bedöma cancer cellväg beroende och läkemedelskänning1. De vanligaste PDX-modellerna är etablerade genom subkutan eller orthotopic implantation av mänskliga tumörceller-en tumör fragment, ett kluster av dissocierade tumör-härledda celler, eller ett prov av isolerade cirkulerande tumörceller (CTC)-till en gnagare värd. Om tumören “ta” är framgångsrik, xenograft cellerna kommer att föröka sig, vaskulär, och på annat sätt interagera med värdvävnaden för att skapa en tumör, som kan skördas i en optimal storlek, subdivided, och åter implanteras i andra värdar. Bland deras många fördelar som ett modellsystem, PDXs behåller vanligtvis en betydande del av den inhemska tumörcellpopulationens heterogenitet och möjliggör bedömning av human-specifika vägar och cellsvar2,3. In vivo sammanhang möjliggör tumör interaktion med vasculature och andra intilliggande stroma och rekapituler vävnad egenskaper såsom läkemedel diffusion dynamik, syre spänning och extracellulära matris inflytande som biologiskt och mekaniskt inverkan tumör progression. En negativ aspekt av PDXs är deras tillit till en gnagare värd, både för tumör expansion och i slutändan för hypotestestning. Eftersom många PDXs inte kan anpassa sig till traditionella tvådimensionella (2D) kultur på vävnad kultur polystyren utan att förlora många av sina önskvärda egenskaper, har det varit minimal medelväg för forskare mellan denna relativt kontrollerade in vitro-metoden, och den betydande ökningen av kostnader, anläggningar och tidskrav för in vivo PDX användning.
Vi har beskrivit flera in vitro-modeller som implementerar 3D-cellkultur inom en stödjande matris, och nyligen utökat det arbetet med att demonstrera den ex vivo-kulturen av multipel prostatacancer (PCa)-derived PDXs, både ensam och i samkultur med benmärgshärledda fibroblaster4,5. Hyaluronsyra (HA)-baserade hydrogelmatriser ger anpassningsbart och biologiskt relevant stöd för båda celltyperna, med facile kontroll över hydrogelegenskaper och optisk klarhet för avbildning genom hydrogeldjupet6.
Mogna PDX tumör vävnader omfattar en variabel blandning av heterogena mänskliga cancerceller och mus stroma (fibroblaster, endotelceller, etc.). För att studera cell-typ specifika bidrag till tumörprogression in vitro, kan det vara fördelaktigt att dissociate tumörer, separera cellpopulationerna, och experimentellt införliva dem på ett organiserat sätt att dissekera vägar av intercellulär kommunikation. De blandade cellpopulationerna inom vävnadsrentappat har differentiell kompatibilitet med specifika odlingsförhållanden. Till exempel, tumör-associerade fibroblast livskraft kräver antingen yta följsamhet eller 3D matriser funktionaliserade med integrin ligander, medan epitelial-härledda PDX celler inte vanligtvis har dessa krav, i stället gynnar cell-cell interaktioner. Dessa skillnader kan utnyttjas för att uppnå effektiv separation av PDX-celler från förorenande mus stromal celler. Rotationskultur av vävnadsuppspjäll tillåter stromal cell adherence till vävnadskulturens yta medan cell-cell adhesions driver PDX-celler som flyter ovanför den roterande odlingsytan för att bilda flercelliga kluster i supernatanten i 24−48 h. De specifika egenskaperna hos dessa kluster varierar med PDX (t.ex. stora, täta, mycket sfäriska kluster eller mindre, lösare aggregat som liknar druvklasar), men är typiskt av biologiskt relevanta storlekar (50−250 μm diameter), tillräckligt för bedömning av cellulära interaktioner som är beroende av intercellulära kontakter.
Tumör hämtning och bearbetning oundvikligen resulterar i en viss grad av säkerheter celldöd, antingen på grund av kortsiktiga skador från mekaniska/enzymatiska störningar, eller långsiktiga inkompatibilitet av subpopulations med de valda odlingsförhållandena. Trots nyttan av rotation kultur som en inledande bulk separation, döda eller döende celler överförs oundvikligen med PDX kluster och kan påverka den resulterande kulturen. Dessa döda celler är ofta enskilda PDX-celler som inte integrerades i ett kluster, mus stromal fibroblaster som inte kan överleva i utvalda odlingsförhållanden, eller särskilt bräckliga endotelceller. Sådana döende celler kan påverka experimentella resultat från “överlevande” och kan avsevärt påverka kvantifiering, t.ex. För att förbättra urvalet av levande PDX-celler från denna metod anpassade vi centrifugeringsmetoder med densitetssteg för att enkelt avlägsna enskilda döda/döende celler från PDX-blandningar och behålla övervägande levande flercelliga kluster.
För att förbättra studiet av resulterande PDX-härledda kluster i 3D-kultur, vi utnyttjade en microfluidics-baserade perfusion kultur plattform, den OrganoPlate (Figur 1), som är en hög genomströmning organ-på-ett-chip plattform som möjliggör samtidig kultur av upp till 96 enskilda perfunderas, 3D kulturer på en 384-väl mikrotiter plattan-bas (Figur 1A)7,8. I den 2-flik mikrofluidiska plattan, är en enda vävnad chip ansluten med två mikrofluidiska kanaler (Figur 1B, gel kanal: röd, perfusion kanal: blå) som spänner över fyra brunnar i rad. De två mikrofluidiska kanalerna är åtskilda av en kort plast ås kallas en Phaseguide som förhindrar överflöd av en kanal i sin intilliggande granne kanal, och samtidigt möjliggör ett membranfritt gränssnitt mellan innehållet i gelen och perfusion kanal9. Eftersom botten av den mikrofluidiska plattan består av mikroskop-grade glas, kan kulturerna ses i observationsfönstret genom botten av plattan med en standard eller automatiserad mikroskop. Perfusion är etablerad i den mikrofluidiska plattan med en programmerbar vipp, med hjälp av tyngdkraften för att driva media genom de mikrofluidiska kanalerna, mellan reservoar brunnar (Figur 1C). Perfusion flöde-härma närmare rekapituler tumören mikromiljö än statisk kultur, vilket möjliggör införlivande av skjuvning stress och förbättrad fördelning av gaser och näringsämnen. Fördelarna med att upprätthålla en perfunderad cancer cell kultur i mikrofluidic plattan har tidigare beskrivits som perfused bröstcancer kulturer uppvisade optimal livskraft jämfört med en statisk 3D-kultur av samma celler7.
Den föreliggande rapporten beskriver en anpassad densitet gradient centrifugation metod för att isolera levande multicellulära PDX kluster och visar sitt nytta i upprättandet 3D PDX kulturer inom perfusable microfluidic plattor. Eftersom ett ökande antal forskningslaboratorier söker metoder för att underlätta PDX-användning, räknar vi med att de protokoll som presenteras här kommer att vara av omedelbar nytta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en metod för bearbetning och odling livskraftiga PDX-härledda tumörceller i en hög genomströmning, perfused 3D-kultur system. Medan detta protokoll utnyttjar PCa PDX vävnad, Det är lika effektivt för andra epitelial-härledda tumörer. Tumör egenskaper varierar mellan enskilda PDX linjer även inom samma vävnad av ursprung (prostata, bröst, etc.). Vissa PCa PDX linjer är mer fibrotisk och svårt att isolera livskraftiga celler från medan andra är mer cellulära. Tumören storlek noteras h?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health National Cancer Institute SBIR fas I (HHSN26120700015C) och P01CA098912.
Materials
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
References
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Recherche en cancérologie. 77 (21), 62-66 (2017).
- Fong, E. L. S., et al. Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).
- Fong, E. L. S., et al. A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions. Biomaterials. 77, 164-172 (2016).
- Engel, B. J., et al. Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures. Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).
- Lanz, H. L., et al. Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform. BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).
- Wevers, N. R., et al. High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform. Scientific Reports. 6, 38856 (2016).
- Vulto, P., et al. Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying. Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).
- Patru, C., et al. CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors. BMC Cancer. 10, 66 (2010).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).
