फास्ट-स्कैन साइक्लिक वोल्टामेट्री (सीआईएस-एफएससीवी) के साथ संयुक्त जलसेक और उत्तेजना फेसिक डोपामाइन के वेंट्रल टेगमेंटल एरिया रिसेप्टर विनियमन का आकलन करने के लिए
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य सीधे वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र रिसेप्टर्स में हेरफेर करना है ताकि वे सबसेकंड डोपामाइन रिलीज में उनके योगदान का अध्ययन कर सके।
Abstract
वेंट्रल टेगमेंटल एरिया (वीटीए) से नाभिक एक्यूबेन्स को फेसिक डोपामाइन (डीए) रिलीज इनाम प्रसंस्करण और सुदृढीकरण सीखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। वीटीए नियंत्रण फेसिक डीए रिलीज में विविध न्यूरोनल इनपुट कैसे समझते हैं, सर्किटरी की एक बेहतर तस्वीर प्रदान कर सकते हैं जो इनाम प्रसंस्करण और सुदृढीकरण सीखने को नियंत्रित करता है। यहां, हम एक ऐसी विधि का वर्णन करते हैं जो उत्तेजना-पैदा किए गए फेसिक डीए रिलीज (संयुक्त जलसेक और उत्तेजना, या सीआईएस) के साथ औषधीय एगोनिस्टों और विरोधी के इंट्रा-वीटीए कैनुला इन्फ्यूजन को जोड़ती है, जैसा कि वीवो फास्ट-स्कैन चक्रीय वोल्टैममेट्री (एफएससीवी) में मापा जाता है। एनेस्थेटाइज्ड चूहों में सीआईएस-एफएससीवी का उपयोग करके, नाभिक एक्यूबेन्स कोर में रिकॉर्डिंग करते समय एक कैनुला के साथ लगे द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड के साथ वीटीए को विद्युत रूप से उत्तेजित करके एक चरणबद्ध डीए प्रतिक्रिया पैदा की जा सकती है। औषधीय agonists या विरोधी चरणबद्ध डीए रिलीज ड्राइविंग में विशिष्ट वीटीए रिसेप्टर्स की भूमिकाओं की जांच करने के लिए उत्तेजना स्थल पर सीधे संचार किया जा सकता है । सीआईएस-एफएससीवी का एक बड़ा लाभ यह है कि वीटीए रिसेप्टर फ़ंक्शन का अध्ययन वीवो में किया जा सकता है, इन विट्रो अध्ययनों का निर्माण किया जा सकता है।
Introduction
फेसिक डोपामाइन (डीए) वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र (वीटीए) से नाभिक एक्यूबेन्स (एनी) को जारी करना इनाम से संबंधित व्यवहार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। वीटीए दा न्यूरॉन्स एक टॉनिक जैसी फायरिंग (3-8 हर्ट्ज) से एक फट-फायरिंग (>14 हर्ट्ज)1में स्विच करते हैं, जो एनएसी में फेसिक डीए रिलीज का उत्पादन करता है । वीटीए विभिन्न प्रकार के सोमाटोडेंडिटिक रिसेप्टर्स को व्यक्त करता है जो टॉनिक से फट-फायरिंग 2 , 3,4 ,5तक स्विच कोनियंत्रितकरने के लिए अच्छीतरहसे तैनात हैं। इन रिसेप्टर्स में से कौन सा पहचान, और उनके संबंधित आदानों, नियंत्रण phasic दा रिलीज कैसे इनाम से संबंधित circuitry आयोजित किया जाता है की हमारी समझ गहरा होगा । यहां वर्णित पद्धति का उद्देश्य, तेजी से स्कैन साइक्लिक वोल्टैममेट्री (सीआईएस-एफएससीवी) के साथ संयुक्त जलसेक और उत्तेजना, चरणबद्ध डीए रिलीज को चलाने में वीटीए रिसेप्टर्स की कार्यक्षमता का जल्दी और मजबूती से आकलन करना है।
संयुक्त जलसेक और उत्तेजना (सीआईएस) शब्द न्यूरॉन्स (यहां वीटीए) के एक समूह पर औषधीय रूप से हेरफेर रिसेप्टर्स को संदर्भित करता है और रिसेप्टर के कार्य का अध्ययन करने के लिए उन न्यूरॉन्स को उत्तेजित करता है। एनेस्थेटाइज्ड चूहे में, हम वीटीए को एनएसी कोर में एक बड़े फेसिक डीए सिग्नल (1-2 माइक्रोनएम) पैदा करने के लिए विद्युत रूप से उत्तेजित करते हैं, जैसा कि फास्ट-स्कैन चक्रीय वोल्टैममेट्री (एफएससीवी) द्वारा मापा जाता है। उत्तेजना स्थल पर औषधीय दवाओं (यानी, रिसेप्टर एगोनिस्ट/विरोधी) के इन्फ्यूजन का उपयोग बाद में हुए फेसिक डीए रिलीज में बाद में हुए परिवर्तन को देखकर वीटीए रिसेप्टर्स के कार्य को मापने के लिए किया जा सकता है। एफएससीवी एक इलेक्ट्रोकेमिकल दृष्टिकोण है जो उच्च स्थानिक (50-100 माइक्रोन) और अस्थायी (10 हर्ट्ज) संकल्प दोनों प्राप्त करता है, और इनाम से संबंधित, फेसिक डीए घटनाओं6, 7को मापने के लिए अच्छीतरहसे अनुकूल है। यह संकल्प वीवो न्यूरोकेमिकल मापों में अन्य की तुलना में बेहतर है, जैसे माइक्रोडायलिसिस। इस प्रकार, एक साथ, सीआईएस-एफएससीवी फेसिक डोपामाइन रिलीज के वीटीए रिसेप्टर विनियमन का आकलन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।
वीटीए रिसेप्टर कार्य की जांच करने का एक सामान्य तरीका इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोणों के संयोजन का उपयोग करना है जो यह पता लगाते हैं कि वे रिसेप्टर्स न्यूरॉन्स 1,8की गोलीबारी दर को कैसेबदलतेहैं । इन अध्ययनों को समझने में अत्यधिक मूल्यवान है जो रिसेप्टर्स सक्रियण पर दा फायरिंग ड्राइविंग में शामिल हैं । हालांकि, ये अध्ययन केवल यह सुझाव दे सकते हैं कि एक्सॉन टर्मिनल (यानी, न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई) पर डाउनस्ट्रीम क्या हो सकता है। सीआईएस-एफएससीवी इन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों पर इस बात का जवाब देकर बनाता है कि वीटीए फट-फायरिंग, फेसिक डीए रिलीज का आउटपुट वीटीए डेंड्राइट्स और सेल निकायों पर स्थित रिसेप्टर्स द्वारा कैसे विनियमित किया जाता है। इस प्रकार, सीआईएस-एफएससीवी इन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययनों पर निर्माण करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। एक उदाहरण के रूप में, निकोटीन रिसेप्टर सक्रियण वीटीए9में फट-फायरिंग को प्रेरित कर सकता है, और एनेस्थेटाइज्ड चूहे में सीआईएस-एफएससीवी का उपयोग यह दिखाने के लिए किया गया था कि वीटीए में निकोटीन एसीटिलकोलिन रिसेप्टर (एनसीएएचआर) सक्रियण भी एनएसी10, 11में फेसिक डीए रिलीज कोनियंत्रितकरता है।
फेसिक डीए विनियमन की मशीनी परीक्षा भी आमतौर पर दवाओं के स्नान आवेदन के साथ टुकड़ा तैयारी का उपयोग कर अध्ययन किया जाता है। ये अध्ययन अक्सर डोपामाइन टर्मिनलों से फेसिक डीए रिलीज के प्रेसिनैप्टिक नियमन पर ध्यान केंद्रित करते हैं, क्योंकि सेल निकायों को अक्सर स्लाइस12से हटा दिया जाता है। ये तैयारी डोपामाइन टर्मिनलों पर प्रेसिनैप्टिक रिसेप्टर प्रभावों का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान हैं, जबकि सीआईएस-एफएससीवी डोपामाइन न्यूरॉन्स पर सोमाटोडेंडिट रिसेप्टर प्रभावों का अध्ययन करने के साथ-साथ वीटीए के लिए प्रेसिनैप्टिक इनपुट के लिए बेहतर अनुकूल है। यह अंतर महत्वपूर्ण है, क्योंकि वीटीए में सोमाटोडेंड्रिटिक रिसेप्टर एक्टिवेशन का एनएएसी प्रेसिनैप्टिक रिसेप्टर एक्टिवेशन की तुलना में अलग प्रभाव हो सकता है। दरअसल, एनएसी में डोपामिनेर्गिक प्रेसिनैप्टिक एनएएचआर अवरुद्ध फट-फायरिंग13के दौरान फेसिक डोपामाइन रिलीज को ऊंचा कर सकते हैं, जबकि इसके विपरीत वीटीए सोमाटोडेन्ड्रिक 10,11में सच है।
सीआईएस-एफएससीवी चरणबद्ध डीए रिलीज को विनियमित करने के लिए वीटीए रिसेप्टर्स की क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श दृष्टिकोण है। महत्वपूर्ण बात, इस दृष्टिकोण को एक अक्षुण्ण चूहे में किया जा सकता है, या तो एनेस्थेटाइज्ड या मुफ्त चलती है। यह दृष्टिकोण तीव्र अध्ययनों के लिए उपयुक्त है, अपने बेसलाइन राज्य10, 14में रिसेप्टर फ़ंक्शन का अध्ययन करने के साथ-साथदीर्घकालिक अध्ययन जो दवा जोखिम या व्यवहार हेरफेर11, 15के बाद रिसेप्टर में कार्यात्मक परिवर्तनों का आकलन कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीआईएस-एफएससीवी चरणबद्ध डीए रिलीज में अंतर्निहित वीटीए रिसेप्टर तंत्र की जांच करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। उचित रिकॉर्डिंग सुनिश्चित करने के लिए दो महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, एक स्थिर ब?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
काम एलिजाबेथटाउन कॉलेज (आरजेडब्ल्यू, एमएल, और एल.M) द्वारा समर्थित था, एक एनएसएफ ग्रेजुएट फैलोशिप (आरजेडब्ल्यू) द्वारा और येल स्कूल ऑफ मेडिसिन (एनए) द्वारा ।
Materials
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | – | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
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