עירוי וגירוי משולבים עם וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (CIS-FSCV) כדי להעריך ויסות קולטן אזור טגמנטלי גחוני של דופמין פאזי
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לתפעל ישירות קולטני אזור tegmental גחוני ללמוד את תרומתם לשחרור דופמין תת שנייה.
Abstract
שחרור דופמין פאסיק (DA) מהאזור הטגמנטלי הגחוני (VTA) לגרעין האקומבנס ממלא תפקיד מרכזי בעיבוד תגמול ולמידה חיזוק. הבנת האופן שבו התשומות העצביות המגוונות לתוך שחרור DA פאזי של בקרת VTA יכולה לספק תמונה טובה יותר של המעגלים השולטים בעיבוד תגמול ולמידת חיזוק. כאן, אנו מתארים שיטה המשלבת חליטות צינוריות פנים-VTA של אגוניסטים ואנטגוניסטים רוקח עם שחרור DA פאזי מעורר גירוי (עירוי וגירוי משולב, או CIS) כפי שנמדד על ידי voltammetry מחזורי סריקה מהירה (FSCV). באמצעות CIS-FSCV בחולדות מרדים, תגובת DAphasic יכול להיות מעורר על ידי גירוי חשמלי VTA עם אלקטרודה דו קוטבית מצוידת צינורית תוך הקלטה בליבת גרעין האקומבנס. אגוניסטים רוקח או אנטגוניסטים ניתן להחדיר ישירות באתר הגירוי כדי לחקור תפקידים ספציפיים של קולטני VTA בנהיגה שחרור DAphasic. היתרון העיקרי של CIS-FSCV הוא כי תפקוד קולטן VTA ניתן ללמוד ב vivo, בניית מחקרים במבחנה.
Introduction
שחרור דופמין פאסיק (DA) מהאזור הטגמנטלי הגחוני (VTA) לגרעין האקומבנס (NAc) ממלא תפקיד חיוני בהתנהגויות הקשורות לתגמול. נוירונים VTA DA לעבור מירי דמוי טוניק (3-8 הרץ) לירי דמוי פרץ (>14 הרץ)1, אשר מייצר שחרור DA פאזי ב- NAc. VTA מבטא מגוון של קולטנים סומטונדריטיים הממוקמים היטב כדי לשלוט על המתג מטוניק לפרץירי 2,3,4,5. זיהוי אילו קולטנים אלה, והתשומות המתאימות להם, שחרור DA פאזי שליטה יעמיקו את הבנתנו כיצד מאורגנים המעגלים הקשורים לתגמול. מטרת המתודולוגיה המתוארת כאן, עירוי וגירוי משולבים עם וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (CIS-FSCV), היא להעריך במהירות ובחזקה את הפונקציונליות של קולטני VTA בנהיגה שחרור DAphasic.
המונח עירוי וגירוי משולבים (CIS) מתייחס קולטנים מניפולציה פרמקולוגית על קבוצה של נוירונים (כאן VTA) וממריץ נוירונים אלה ללמוד את תפקוד הקולטן. בחולדה המרדים, אנו מעוררים חשמלית את ה- VTA לעורר אות DA פאזי גדול (1-2 מיקרומטר) בליבת NAc, כפי שנמדד על ידי וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (FSCV). חליטות של תרופות פרמקולוגיות (כלומר, אגוניסטים קולטן/אנטגוניסטים) באתר הגירוי ניתן להשתמש כדי למדוד את הפונקציה של קולטני VTA על ידי התבוננות בשינוי הבא בשחרור DA פאזי מעורר. FSCV היא גישה אלקטרוכימית הנהנית הן מרחבית גבוהה (50-100 מיקרומטר) והן רזולוציה זמנית (10 הרץ), ומתאימה היטב למדוד אירועי DA פאזיים הקשורים לתגמול6,7. רזולוציה זו עדינה יותר ממדידות נוירוכימיות אחרות של vivo, כגון מיקרודיאליזה. לכן, יחד, CIS-FSCV מתאים היטב כדי להעריך ויסות קולטן VTA של שחרור דופמין פאזי.
דרך נפוצה אחת לחקור את תפקוד קולטן VTA היא באמצעות שילוב של גישות אלקטרופיזיולוגיות המטפלות באופן שבו קולטנים אלה משנים את קצב הירי של נוירונים1,8. מחקרים אלה הם בעלי ערך רב בהבנת מה קולטנים מעורבים בהנעת DA ירי בעת ההפעלה. עם זאת, מחקרים אלה יכולים רק להציע מה עלול לקרות במורד הזרם במסוף אקסון (כלומר, שחרור של נוירוטרנסמיטר). CIS-FSCV בונה על מחקרים אלקטרופיזיולוגיים אלה על ידי מענה כיצד הפלט של VTA פרץ ירי, שחרור DA פאזי, מוסדר על ידי קולטנים הממוקמים על דנדריטים VTA וגופי תאים. לכן, CIS-FSCV מתאים היטב לבנות על מחקרים אלקטרופיזיולוגיים אלה. כדוגמה, הפעלת קולטן nicotinic יכול לגרום יריפרץב VTA 9 , ו CIS-FSCV בחולדה מרדים שימש כדי להראות כי קולטן אצטילכולין nicotinic (nAChR) הפעלת VTA גם שולט שחרור DA פאזי ב NAc10,11.
בדיקה מכנית של רגולציה DAphasic נלמד גם בדרך כלל באמצעות תכשירי פרוסה יחד עם יישום אמבטיה של תרופות. מחקרים אלה מתמקדים לעתים קרובות ברגולציה presynaptic של שחרור DAphasic מסופי דופמין, כמו גופי התא מוסרים לעתים קרובות מן הפרוסה12. תכשירים אלה הם בעלי ערך לחקר השפעות קולטן presynaptic על מסופי דופמין, בעוד CIS-FSCV מתאים יותר ללמוד השפעות קולטן סומטונדריטי על נוירונים דופמין, כמו גם תשומות presynaptic ל- VTA. הבחנה זו חשובה, כי הפעלת קולטן somatodendritic ב- VTA עשוי להיות השפעה שונה מאשר הפעלת קולטן פרסינפטי NAc. ואכן, חסימת דופאמין presynaptic nAChRs ב NAc יכול להעלות את שחרור דופמין פאזי במהלך פרץ ירי13, ואילו ההפך נכון VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV היא גישה אידיאלית לחקר היכולת של קולטני VTA לווסת את שחרור DA פאזי. חשוב לציין, גישה זו יכולה להתבצע בחולדה שלמה, או מרדים או לנוע חופשי. גישה זו מתאימה למחקרים חריפים, כדי לחקור את תפקוד הקולטן במצב הבסיסי שלה10,14, כמו גם מחקרים ארוכי טווח שיכולים להעריך שינויים תפקודיים קולטן לאחר חשיפה לסמים או מניפולציה התנהגותית11,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
CIS-FSCV מספק הזדמנות ייחודית לחקור מנגנוני קולטן VTA שבבסיס שחרור DA פאזי. ישנם שני שלבים קריטיים על מנת להבטיח הקלטה נכונה. ראשית, יש להשיג הקלטה בסיסית יציבה, עם מעט סחיפה באות DA המעורר. דרך חשובה להגדיל את הסבירות להקמת הקלטה יציבה היא להבטיח כי האלקטרודה היה מספיק זמן מחזור הן 60 הרץ ו 10 הרץ (בד…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכה על ידי מכללת אליזבתטאון (R.J.W, M.L., ו- L.M.), על ידי מלגת בוגרי NSF (R.J.W. ) ועל ידי בית הספר לרפואה של ייל (N.A.).
Materials
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | – | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
References
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2877-2890 (1984).
- Lester, D. B., et al. Midbrain acetylcholine and glutamate receptors modulate accumbal dopamine release. Neuroreport. 19 (9), 991-995 (2008).
- Lodge, D. J., Grace, A. A. The laterodorsal tegmentum is essential for burst firing of ventral tegmental area dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5167-5172 (2006).
- Li, C., et al. Mu Opioid Receptor Modulation of Dopamine Neurons in the Periaqueductal Gray/Dorsal Raphe: A Role in Regulation of Pain. Neuropsychopharmacology. 41 (8), 2122-2132 (2016).
- Zhang, H. Y., et al. Expression of functional cannabinoid CB2 receptor in VTA dopamine neurons in rats. Addiction Biology. 22 (3), 752-765 (2017).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Frontiers in Bioscience. 5, 982-999 (2013).
- Wightman, R. M., et al. Monitoring of transmitter metabolites by voltammetry in cerebrospinal fluid following neural pathway stimulation. Nature. 262 (5564), 145-146 (1976).
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: single spike firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2866-2876 (1984).
- Mameli-Engvall, M., et al. Hierarchical control of dopamine neuron-firing patterns by nicotinic receptors. Neuron. 50 (6), 911-921 (2006).
- Wickham, R., et al. Ventral tegmental area alpha6beta2 nicotinic acetylcholine receptors modulate phasic dopamine release in the nucleus accumbens core. Psychopharmacology. 229 (1), 73-82 (2013).
- Solecki, W., et al. Differential role of ventral tegmental area acetylcholine and N-methyl-D-aspartate receptors in cocaine-seeking. Neuropharmacology. 75, 9-18 (2013).
- John, C. E., Jones, S. R., Michael, A. C., Borland, L. M. Fast Scan Cyclic Voltammetry of Dopamine and Serotonin in Mouse Brain Slices. Electrochemical Methods for Neuroscience. , (2007).
- Rice, M. E., Cragg, S. J. Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum. Nature Neuroscience. 7 (6), 583-584 (2004).
- Espana, R. A., et al. Hypocretin 1/orexin A in the ventral tegmental area enhances dopamine responses to cocaine and promotes cocaine self-administration. Psychopharmacology. 214 (2), 415-426 (2011).
- Addy, N. A., et al. The L-type calcium channel blocker, isradipine, attenuates cue-induced cocaine-seeking by enhancing dopaminergic activity in the ventral tegmental area to nucleus accumbens pathway. Neuropsychopharmacology. 43 (12), 2361-2372 (2018).
- Hermans, A., Wightman, R. M. Conical tungsten tips as substrates for the preparation of ultramicroelectrodes. Langmuir. 22 (25), 10348-10353 (2006).
- Borland, L. M., Michael, A. C., Borland, L. M., Michael, A. C. An Introduction to Electrochemical Methods in Neuroscience. Electrochemical Methods for Neuroscience. , (2007).
- Mundroff, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Current Protocols in Neuroscience. 6 (6), 14 (2002).
- Rodeberg, N. T., et al. Hitchhiker’s Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for in vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
- Sabeti, J., Gerhardt, G. A., Zahniser, N. R. Chloral hydrate and ethanol, but not urethane, alter the clearance of exogenous dopamine recorded by chronoamperometry in striatum of unrestrained rats. Neuroscience Letters. 343 (1), 9-12 (2003).
- Masuzawa, M., et al. Pentobarbital inhibits ketamine-induced dopamine release in the rat nucleus accumbens: a microdialysis study. Anesthesia & Analgesia. 96 (1), 148-152 (2003).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. Journal of Neuroscience. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Keithley, R. B., et al. Higher sensitivity dopamine measurements with faster-scan cyclic voltammetry. Analytical Chemistry. 83 (9), 3563-3571 (2011).
- Jackson, B. P., Dietz, S. M., Wightman, R. M. Fast-scan cyclic voltammetry of 5-hydroxytryptamine. Analytical Chemistry. 67 (6), 1115-1120 (1995).
- Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
- Wenzel, J. M., et al. Phasic Dopamine Signals in the Nucleus Accumbens that Cause Active Avoidance Require Endocannabinoid Mobilization in the Midbrain. Current Biology. 28 (9), 1392-1404 (2018).
- Spanos, M., et al. NMDA Receptor-Dependent Cholinergic Modulation of Mesolimbic Dopamine Cell Bodies: Neurochemical and Behavioral Studies. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1497-1505 (2019).
- Cheer, J. F., et al. Cannabinoids enhance subsecond dopamine release in the nucleus accumbens of awake rats. Journal of Neuroscience. 24 (18), 4393-4400 (2004).
- Melchior, J. R., et al. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Robinson, D. L., et al. Monitoring rapid chemical communication in the brain. Chemical Reviews. 108 (7), 2554-2584 (2008).
- Park, J., et al. Heterogeneous extracellular dopamine regulation in the subregions of the olfactory tubercle. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 365-377 (2017).
- Ganesana, M., Venton, B. J. Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury. PLoS One. 13 (5), e0196932 (2018).
