Infusão e Estimulação Combinada com Voltammetry Cíclica de Varredura Rápida (CIS-FSCV) para avaliar a regulação do receptor da área tegmental ventral da dopamina fástica
Summary
O objetivo deste protocolo é manipular diretamente os receptores da área tegmental ventral para estudar sua contribuição para a liberação de dopamina subsegundo.
Abstract
A liberação de dopamina phasic (DA) da área tegmental ventral (VTA) para o núcleo accumbens desempenha um papel fundamental no processamento de recompensas e aprendizado de reforço. Entender como as diversas entradas neuronais na liberação da DA de controle VTA podem fornecer uma melhor imagem dos circuitos que controlam o processamento de recompensas e o aprendizado reforçado. Aqui, descrevemos um método que combina infusões de cânulas intra-VTA de agonistas farmacológicos e antagonistas com a liberação de DA fásica evocada por estimulação (infusão e estimulação combinada, ou CIS) medida pela voltametria cíclica in vivo de varredura rápida (FSCV). Usando CIS-FSCV em ratos anestesiados, uma resposta da DA fásica pode ser evocada estimulando eletricamente o VTA com um eletrodo bipolar equipado com uma cânula durante a gravação no núcleo do núcleo accumbens. Agonistas ou antagonistas farmacológicos podem ser infundidos diretamente no local de estimulação para investigar os papéis específicos dos receptores de VTA na liberação da DA fásica. Um grande benefício do CIS-FSCV é que a função receptorA VTA pode ser estudada in vivo, com base em estudos in vitro.
Introduction
A liberação de dopamina phasic (DA) da área tegmental ventral (VTA) para o núcleo accumbens (NAc) desempenha um papel vital em comportamentos relacionados à recompensa. Os neurônios VTA DA mudam de um disparo tônico (3-8 Hz) para um disparo em forma de estouro (>14 Hz)1, que produz a liberação da DA phasic no NAc. O VTA expressa uma variedade de receptores somatodendritic que estão bem posicionados para controlar o interruptor de tônica para estouro2,3,4,5. Identificar quais desses receptores, e seus respectivos insumos, controlarão a liberação da DA phasic aprofundará nossa compreensão de como os circuitos relacionados à recompensa são organizados. O objetivo da metodologia aqui descrita, infusão combinada e estimulação com voltametria cíclica de varredura rápida (CIS-FSCV), é avaliar de forma rápida e robusta a funcionalidade dos receptores VTA na liberação da DA fásica.
O termo infusão e estimulação combinada (CEI) refere-se a receptores farmacologicamente manipuladores em um grupo de neurônios (aqui o VTA) e estimular esses neurônios a estudar a função do receptor. No rato anestesiado, estimulamos eletricamente o VTA para evocar um grande sinal da fásico (1-2 μM) no núcleo NAc, medido pela voltammetry cíclica de varredura rápida (FSCV). Infusões de fármacos farmacológicos (ou seja, agonistas receptores/antagonistas) no local de estimulação podem ser usadas para medir a função dos receptores VTA observando a mudança subsequente na liberação da FAsica evocada. FSCV é uma abordagem eletroquímica que desfruta tanto de alta resolução espacial (50-100 μm) quanto temporal (10 Hz), e é adequada para medir eventos da DA relacionados à recompensa6,7. Esta resolução é mais fina do que outras medidas neuroquímicas in vivo, como a microdiálise. Assim, em conjunto, o CIS-FSCV é adequado para avaliar a regulação do receptor VTA da liberação de dopamina fásica.
Uma maneira comum de investigar a função do receptor de VTA é usando uma combinação de abordagens eletrofisiológicas que abordam como esses receptores alteram a taxa de disparo dos neurônios1,8. Esses estudos são altamente valiosos para entender quais receptores estão envolvidos na condução de disparos da promotoria após a ativação. No entanto, esses estudos só podem sugerir o que pode acontecer a jusante no terminal de axônio (ou seja, liberação de um neurotransmissor). O CIS-FSCV baseia-se nesses estudos eletrofisiológicos, respondendo como a saída de disparo de VTA, liberação de DA fásica, é regulada por receptores localizados em dendritos de VTA e corpos celulares. Assim, o CIS-FSCV é adequado para se basear nesses estudos de eletrofisiologia. Como exemplo, a ativação do receptor nicotínico pode induzir o disparo de explosão no VTA9, e o CIS-FSCV no rato anestesiado foi usado para mostrar que a ativação do receptor de acetilcolina nicotínica (nAChR) no VTA também controla a liberação da Fásica no NAc10,11.
O exame mecanicista da regulação da da afásica também é comumente estudado usando preparações de fatias juntamente com a aplicação de banho de drogas. Esses estudos muitas vezes se concentram na regulação pré-sináptica da liberação da DA afásica dos terminais de dopamina, uma vez que os corpos celulares são frequentemente removidos da fatia12. Essas preparações são valiosas para estudar efeitos de receptores pré-sinápticos nos terminais de dopamina, enquanto o CIS-FSCV é mais adequado para estudar efeitos do receptor somatodendritico em neurônios de dopamina, bem como entradas pré-sinápticas no VTA. Essa distinção é importante, pois a ativação do receptor somatodendritic no VTA pode ter um efeito diferente da ativação do receptor pré-sináptico NAc. De fato, bloquear nAChRs pré-sinápticas dopaminérgicos no NAc pode elevar a liberação de dopamina afásica durante o estouro13, enquanto o oposto é verdadeiro no VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV é uma abordagem ideal para estudar a capacidade dos receptores VTA de regular a liberação da DA fásica. É importante ressaltar que essa abordagem pode ser realizada em um rato intacto, seja anestesiado ou em movimento livre. Esta abordagem é adequada para estudos agudos, para estudar a função receptora em seu estado de base10,14, bem como estudos de longo prazo que possam avaliar alterações funcionais em um receptor após exposição a medicamentos ou manipulação comportamental11,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
O CIS-FSCV oferece uma oportunidade única para investigar os mecanismos receptores VTA subjacentes à liberação da DA fásica. Há duas etapas críticas para garantir uma gravação adequada. Em primeiro lugar, uma gravação de linha de base estável deve ser alcançada, com pouca deriva no sinal de DA evocado. Uma maneira importante de aumentar a probabilidade de estabelecer um registro estável é garantir que o eletrodo tenha tido tempo de sobra para pedalar tanto a 60 Hz quanto a 10 Hz (tipicamente 15 min a 60 Hz…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi apoiado pela Elizabethtown College (R.J.W, M.L., e L.M.), por uma Bolsa de Pós-Graduação da NSF (R.J.W.) e pela Yale School of Medicine (N.A.).
Materials
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | – | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
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