ホストリガンドからの金属応答遺伝子の特性評価と金属獲得のためのナイセリア淋菌の金属有限成長

Summary

ここでは、金属取り込み用遺伝子の発現を促進するために、金属制限液体培地中の淋菌のナイセリアの増殖方法について説明する。また、これらの条件で増殖したゴノコッカスの表現型を特徴付けるための下流実験についても概説する。これらの方法は、他の細菌における金属応答性遺伝子の特性評価に適するように適合され得る。

Abstract

鉄や亜鉛などの微量金属は、遺伝子調節、触媒、タンパク質構造を含む原核生物プロセスにおいて重要な役割を果たすことが知られている重要な栄養素です。宿主による金属隔離は、しばしば細菌の金属制限をもたらす。この制限は、タンパク質製品が細菌が金属制限された環境を克服することを可能にする細菌遺伝子発現を誘導する。このような遺伝子の特性評価は困難です。細菌は、前述の遺伝子の発現を達成するのに役立つ金属プロファイルを維持しながら細菌の増殖を可能にする栄養金属への十分なアクセスを可能にする綿密に調製された媒体で増殖しなければならない。そのため、これらの金属の濃度に対しては微妙なバランスを確立する必要があります。人間の宿主のみで生き残るために進化してきたナイセリア淋菌のような栄養的に潔癖な生物を育てることは、さらに複雑さを増す。ここでは、ゴノコッカルの増殖及び所望の遺伝子発現を可能にするのに十分な定義済金属限定培地の調製について説明する。この方法により、研究者は、鉄または亜鉛の定義された供給源を培地に補いながら、望ましくない供給源から鉄および亜鉛をキレートすることができ、その調製物も記載されている。最後に、この培地を利用して金属安定化ゴノコッカル遺伝子のタンパク質産物を特徴付ける3つの実験について概説する。

Introduction

ナイセリア淋菌は、一般的な性感染症淋病を引き起こす。感染時、病原性ナイセリアは、細菌がヒト宿主^1、2、3による金属制限の努力を克服することを可能にする金属応答性遺伝子のレパートリーを発現する。鉄や亜鉛などの微量金属は、触媒部位の酵素への結合、酸化還元反応への参加、および様々なタンパク質の構造因子として^4、5などの多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。金属に限られた条件では、金属応答性の遺伝子座は破壊され、その結果生じるタンパク質はこれらの栄養素の獲得を助けることができる。これらの遺伝子およびタンパク質の特性評価は、研究者にとってユニークな技術的課題を提示する。金属イオンは、これらの遺伝子のネイティブ遺伝子の転写を天然の遺伝子から誘導するためには細菌から源泉徴収されなければならないが、金属を含む培地からのこれらのイオンの有効なキラキラを最適化することは困難である。原料水の異なる金属プロファイルと粉末成分の固有のロット間変動⁶は、豊富な媒体から特定の金属を除去するために必要なキレート剤の量が異なる場所、成分ベンダー、さらには化学在庫として単一の実験室内で時間をかけて変化することを意味します。

この課題を回避するために、溶液から微量金属を除去するための調製中にChelex-100樹脂で処理される定義された培地の調製について説明する。この培地は、ヒト宿主の外で培養することが困難であるゴノコッカスの増殖を可能にする十分な栄養密度であり、また、研究者は独自の定義された供給源および濃度を加えることによって特定の金属プロファイルを導入することを可能にする。金属。必要な金属を枯渇させる金属の制御されたアドインの方法は、実験の一貫性を高め、水源や化学ロット数などの要因に関係なく、堅牢で複製可能な実験を可能にします。さらに、この媒体はわずかな変更だけ液体か固体として展開することができる、非常に多目的な。

この培地の有用性を実証するために、ゴノコッカル成長のためのプロトコルを概説し、金属応答性Neisseria遺伝子を特徴付けるための3つの成功した実験について説明する。まず、金属枯渇または補足培養物からゴノコッカス全細胞ライセートを調製し、金属応答性遺伝子座からのタンパク質産生の可変レベルを実証する。次に、特定の有効な亜鉛源の補給によってゴノコッカルの成長を制御する亜鉛制限成長アッセイの概要を説明します。最後に、金属を含むリガンドに結合する金属応答性表面受容体を発現する全ゴノコッカル細胞を示す結合アッセイを示す。これらの受容体の表面提示に成功するには、金属枯渇培地の成長が必要です。

本プロトコルは、ナイセリア淋菌のために特別に最適化されたが、他の多くの細菌病原体は、感染中に金属獲得戦略を採用して^7、このプロトコルは、他の細菌における金属恒常性の研究のために適応され得る。他の細菌で使用するためにこの培地およびこれらの実験プロトコルを最適化するには、他の細菌がゴノコッカスとわずかに異なる金属要件を有する可能性があるため、キレックス-100による金属キレート濃度および/または処理時間のわずかな変更が必要になる可能性があります。鉄と亜鉛は、記載された調査のために懸念される主要な金属であるが、他の金属(例えば、マンガン)は、ナイセリア^{8、9、10、11、12}を含む細菌に対して重要として実証されている。さらに、真核細胞培養作業における金属特性評価についても同様の方法が記載されているが、これも考えられる。¹³

Protocol

1. チェレックス処理済み定義済み培地(CDM)ストックソリューションの調製 ストックソリューションI NaCl(233.8 g)、K2 SO4(40.0 g)、NH4Cl(8.8 g)、K2HPO4(13.9 g)、KH2PO4(10.9 g)をイオン化した水で1Lの最終体積に組み合わせます。 50 mL円錐形チューブに溶液とアリコートを滅菌します。 -20 °Cで保管してください。 …

Representative Results

ナイセリア淋菌の増殖のための微量金属の存在しない特定の定義された媒体が開発され、金属応答性遺伝子とその遺伝子産物の特性評価のために実施された。最適化されたプロトコルでは、メディアの金属プロファイルは、金属ターゲットの滴定キレートではなく、研究者の裁量で金属を追加して制御し、ラボからラボ、実験から実験までの制御と一貫性を高?…

Discussion

成長メディアは、微生物学研究において様々な役割を果たします。特殊なメディアは、多くのユニークなタイプの研究のために、選択、濃縮、および他の様々なアプリケーションに使用されます。そのような用途の1つは、金属応答性遺伝子の誘導であり、これは典型的には、特定の金属イオンを標的とする特定のキレート剤を添加することによって達成される。この方法は限定され、様々な…

Materials

125 mL sidearm flasks	Bellco	2578-S0030	Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol	VWR	M131	Open in fume hood
3MM Paper	GE Health	3030-6461	Called "filter paper" in text
Agarose	Biolone	BIO-41025	Powder
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434	Powder
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501	Powder
Blotting grade blocker	Bio-Rad	170-6404	Nonfat dry milk
Bovine serum albumin	Roche	3116964001	Powder
Bovine transferrin	Sigma-Aldrich	T1428	Powder
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C5080	Powder
Calcium pantothenate	Sigma-Aldrich	C8731	Powder
Calprotectin	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin	Bio-Rad	142-2832	Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab	Puritan	25-806	Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine	Sigma-Aldrich	D9533	Powder
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Powder
Dialysis cassette	Thermo	66380	Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus	Schleicher & Schwell	10484138	Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol	Koptec	V1016	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride	Sigma-Aldrich	F7134	Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate	Sigma-Aldrich	F1143	Irritant, do not inhale
GC medium base	Difco	228950	Powder, already contains agar
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	Powder
HEPES	Fisher	L-15694	Powder
Human transferrin	Sigma-Aldrich	T2030	Powder
Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	Powder
Klett colorimeter	Manostat	37012-0000	Uses color transmission to assess culture density
L-alanine	Sigma-Aldrich	A7627	Powder
L-arginine	Sigma-Aldrich	A5006	Powder
L-asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A8381	Powder
L-aspartate	Sigma-Aldrich	A9256	Powder
L-cysteine hydrochloride	Sigma-Aldrich	C1276	Powder
L-cystine	Sigma-Aldrich	C8755	Powder
L-glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Powder
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G3126	Powder
L-histidine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	H8125	Powder
L-isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752	Powder
L-leucine	Sigma-Aldrich	L8000	Powder
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5501	Powder
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625	Powder
L-phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126	Powder
L-proline	Sigma-Aldrich	P0380	Powder
L-serine	Sigma-Aldrich	S4500	Powder
L-threonine	Sigma-Aldrich	T8625	Powder
L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254	Powder
L-tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754	Powder
L-valine	Sigma-Aldrich	V0500	Powder
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Powder
Methanol	VWR	BDH1135-4LP	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose	GE Health	10600002	Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	60356	Powder
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Powder
Potassium sulfate	Sigma-Aldrich	P0772	Powder
Potato starch	Sigma-Aldrich	S4251	Powder
Reduced glutathione	Sigma-Aldrich	G4251	Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Powder
Sodium chloride	VWR	470302	Powder
Sodium citrate	Fisher	S279	Powder
Sodium hydroxide	Acros Organics	383040010	Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	T4625	Powder
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754	Also called cocarboxylase
TPEN	Sigma-Aldrich	P4413	Powder
Tris	VWR	497	Powder
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750	Powder
Zinc sulfte heptahydrate	Sigma-Aldrich	204986	Irritant, do not inhale