Her karakteriserer vi proteinstruktur og interaktionssteder i levende celler ved hjælp af en proteinaftagende teknik, der kaldes i cellen hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (IC-FPOP).
Hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP) er en hydroxylradikal proteinfodsporsmetode, der bruges til at karakterisere proteinstruktur og interaktioner. FPOP bruger en 248 nm excimer laser til at fotolysere hydrogenperoxid producerer hydroxyl radikaler. Disse radikaler oxidativt ændre opløsningsmiddel eksponeret sidekæder af 19 af de 20 aminosyrer. For nylig, denne metode er blevet anvendt i levende celler (IC-FPOP) til at studere protein interaktioner i deres oprindelige miljø. Studiet af proteiner i celler tegner sig for intermolekylær fortrængning og forskellige proteininteraktioner, der forstyrres for in vitro-studier. Et brugerdefineret enkeltcelleflowsystem er designet til at reducere celleaggregering og tilstopning under IC-FPOP. Dette flow system fokuserer cellerne forbi excimer laser individuelt, hvilket sikrer konsekvent bestråling. Ved at sammenligne omfanget af oxidation fremstillet af FPOP med proteinets opløsningsmiddeltilgængelighed beregnet ud fra en krystalstruktur kan IC-FPOP nøjagtigt sonde proteinernes opløsningsmiddeltilgængelige sidekæder.
Hydroxyl radikalprotein fodaftryk (HRPF) er en metode, der sonderer opløsningsmiddel adgang til et protein gennem kovalente ændringer fremstillet af hydroxyl radikaler. Når proteinstruktur eller proteininteraktioner ændrer sig, vil det ændre opløsningsmiddeleksponeringen af aminosyrer og dermed ændre omfanget af ændringen af restkoncentrationer. Med HRPF er proteininteraktioner1,,2,,3 og proteinkonformationelle ændringer4,5,6 med succes blevet afhørt in vitro. Der er flere metoder, der genererer hydroxyl radikaler for HRPF eksperimenter, hvoraf den ene er hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP). FPOP blev udviklet af Hambly og Gross i 2005 og udnytter en 248 nm excimer laser til at producere hydroxyl radikaler gennem fotolyse af hydrogenperoxid (H2O2)7.
For nylig udvidede Espino et al. brugen af FPOP til at sonde proteinstruktur i levende celler, en metode kaldet in-cell FPOP (IC-FPOP)8. I modsætning til in vitro-undersøgelser, studere proteiner i celler tegner sig for molekylær fortrængning sammen med forskellige protein interaktioner, der potentielt kunne påvirke strukturen. Derudover, det præsenterer den fordel, at give et øjebliksbillede af den fulde proteom potentielt give strukturelle oplysninger om mange systemer på én gang til at udføre proteom bred strukturel biologi. Desuden er denne teknik ideel til proteiner, der er vanskelige at studere in vitro, ligesom membranproteiner.
Indledende undersøgelser af IC-FPOP held undersøgt 105 proteiner spænder i protein overflod og cellulære lokalisering. For at forbedre IC-FPOP-metoden udviklede Rinas et al. et mikroflowsystem til enkeltcelleflow9. Forbedringen af det oprindelige flowsystem begrænser celleaggregering og øger den tilgængelige H2O2 til bestråling. I det oprindelige flowsystem resulterede cellerne i sammenklumpning i silicaslangen i træsko og ujævn bestråling. Indarbejdelsen af to vandløb af en kappe buffer hydrodynamisk fokuserer cellerne, giver dem mulighed for at flyde individuelt forbi laseren. Inkorporeringen af en separat sprøjte til H2O2 muliggør en mere kontrolleret og optimeret eksponeringstid, der giver højere H2O2-koncentrationer uden bivirkninger. Desuden begrænser inkubationstiden opdelingen af H2O2 ved endogen to. Ved at indarbejde dette nye flowsystem steg det påviste antal proteiner med en FPOP-modifikation 13 gange, hvilket udvidede denne metodes kapacitet til at sonde et væld af proteiner i levende celler. I denne protokol beskrives et generelt IC-FPOP-eksperiment med fokus på samlingen af IC-FPOP-flowsystemet.
Der er udviklet adskillige massespektrometribaserede teknikker til at studere proteinstruktur og protein-ligandkomplekser på en proteomdækkende måde i hele celler eller cellelysater. Disse teknikker omfatter, men er ikke begrænset til, stabilitet af proteiner fra oxidationshastigheden (SPROX), termisk proteomprofilering (TPP), kemisk krydsbinding (XL-MS) og hydroxylradikal proteinfodaftryk (HRPF). Hver teknik har unikke begrænsninger og fordele i forhold til hinanden, som er blevet grundigt gennemgået12. Hver af disse metoder er blevet brugt til proteom bred strukturel biologi til at belyse proteinstruktur og i sidste ende fungere inden for det komplekse cellulære miljø. IC-FPOP er en HRPF teknik, der udnytter hydroxyl radikaler til oxidativt ændre opløsningsmiddel eksponerede sidekæder af aminosyrer, sondering protein struktur og protein-ligand interaktioner inden levedygtige celler13. IC-FPOP er en forbedring af den oprindelige HRPF i levende celler, der brugte Fenton kemi til at generere radikaler på minutter tidsskala14. I denne undersøgelse blev strukturelle ændringer i et integreret membranprotein som reaktion på at sænke bufferens pH- eller ioniske styrke med succes karakteriseret med god oxidationsdækning på tværs af proteinet. Sammenlignet med Fenton kemi, IC-FPOP er meget hurtigere, ændre proteiner på mikrosekund tidsskala, således at den indfødte protein kropsbygning, der skal undersøges.
En vigtig test for IC-FPOP er at bekræfte cellernes levedygtighed efter eksponering for H2O2. Ved hjælp af en 40 cm blandingslinje inkuberes cellerne i H2O2 for ca. 3 s før bestråling. Denne gang kan justeres ved at ændre længden af denne silica slange. Det er bemærkelsesværdigt, at selv om brugen af trypanblå til at teste cellernes levedygtighed viser, at cellernes integritet opretholdes efter H2O 2-inkubation, kan cellerne potentielt være under stress, der påvirker signalveje, der interagerer med H2O2.2 Heldigvis er den korte inkubationstid hurtigere end proteinsyntesen, der giver tillid til, at de tilstedeværende proteiner ikke fremkaldes af H2O2.
Det næste vigtige skridt er at bekræfte korrekt samling af flowsystemet. Når de er samlet, skal du sikre dig, at der ikke er utætheder til stede efter skylning af systemet med den ønskede buffer. Hvis der er utætheder til stede, skal du sørge for, at silicaslangen er skåret korrekt og flugter mod ferruleforatet for at lave en ordentlig forsegling, når den er strammet ned. Alle dele er håndstrammet, så ingen værktøj er nødvendige. Under hvert IC-FPOP-eksperiment skal du sørge for, at de magnetiske omrørere i cellesprøjten forbliver i bevægelse. Denne lille agitation begrænser antallet af celler, der sætter sig i bunden af sprøjten, men er ikke hård nok til at vride cellerne. Efter en løbetur er der ca. 50 μL celler tilbage i sprøjten. Sørg altid for at fortynde dette med et skylningstrin for at begrænse antallet af celler, der overføres til det næste eksperiment. Det anbefales at bruge en frisk cellesprøjte, hvis flere cellebehandlinger sammenlignes. Det er også vigtigt at vælge en passende buffer til de celler, der testes. Nogle buffere slukker hydroxylradikalen, hvilket fører til færre ændringer på proteiner. Xu et al. har vist, at nogle almindeligt anvendte buffere reducere hydroxyl radikal levetid11. DPBS og HBSS er almindelige buffere, der anvendes til IC-FPOP-eksperimenter.
Efter IC-FPOP skal du optimere fordøjelsesprotokollen baseret på de nødvendige parametre. Da FPOP producerer irreversible kovalente ændringer, er der rigelig tid til rådighed til en grundig fordøjelse og oprydning uden at miste mærkningsdækningen. Test og normaliser altid proteinkoncentrationen, så ensartede peptidkoncentrationer belastes for tandemmassespektrometri. Endelig skal du være opmærksom på, at et immunudfældning ikke kan udføres sammen med IC-FPOP. Hvis en FPOP-modifikation er rettet mod interaktionsregionen, sænkes antistoffets affinitet. For at bidrage til at øge identifikationen af FPOP ændringer, 2D-kromatografiske adskillelse trin har vist sig at mere end tredoble antallet af oxiderede peptider opdaget15.
En udfordring ved ethvert FPOP-eksperiment er det komplicerede niveau af dataanalyse på grund af de mulige oxidationsprodukter, der kan opstå. Dette gælder for både in-cell eller in vitro, men er drastisk øget med den ekstra kompleksitet analysere celle lysater. Med yderligere optimering af IC-FPOP flere proteiner med højere modifikation dækninger opstår, hvilket hurtigt gør analysen mere besværlig. Forskydningsmængden af data, der genereres fra et enkelt IC-FPOP-eksperiment, begrænser brugen af manuel validering, hvilket får forskere til at stole mere på software. På grund af dette udviklede Rinas et al. en kvantitationsstrategi for HRPF ved hjælp af Proteome Discoverer (PD)16. Denne metode bruger en arbejdsproces for en platform med flere søgninger i PD kombineret med en kvantitativ platform i et regneark. Yderligere forbedringer på IC-FPOP platformen er i gang for at øge antallet af identificerede peptider med FPOP-modifikationer sammen med øget reproducerbarhed og kvantificeringsnøjagtighed.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NSF CAREER Award (MCB1701692) for LMJ.
15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | any brand is sufficient |
500 µL SGE Gastight Syringes: Fixed Luer-Lok Models | Fisher Scientific | SG-00723 | |
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ACQUITY UPLC M-Class System | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | 04A-4299 | |
Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | EX350 excimer laser | |
FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Science | 1548L | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
Legato 210 syringe pump | KD Scientific | 788212 | Any syringe pump that can hold 4, 5 mL syringes, withdraw and expel liquid, and have a way to stale the motor should work |
Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Science | P-618L | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
N,N'-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-242X | |
NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-246 | |
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 88702 | |
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32" | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 150 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP150350 | Polymicro Technologies | 1068150024 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450 µm, Outer Diameter 670 µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150025 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel™ (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-259X | |
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Science | P-255X | |
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | PI89900 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Upchurch Scientific Low-Pressure Crosses: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-182 | |
Upchurch Scientific Low-Pressure Tees: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-178 | |
UV Fused Silica Plano-Convex Spherical Lenses | THORLABS | LA4052 | |
V&P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000 | V&P Scientific, Inc. | VP724F | |
VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Science | UH-436 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |