Hier charakterisieren wir Proteinstruktur und Interaktionsstellen in lebenden Zellen mit einer Protein-Footprinting-Technik, die als zellschnelle photochemische Oxidation von Proteinen (IC-FPOP) bezeichnet wird.
Die schnelle photochemische Oxidation von Proteinen (FPOP) ist eine Methode zur Charakterisierung der Proteinstruktur und -wechselwirkungen. FPOP verwendet einen 248 nm Excimer-Laser, um Wasserstoffperoxid zu photolysieren, der Hydroxylradikale produziert. Diese Radikale verändern oxidativ lösungsmittelexponierte Seitenketten von 19 der 20 Aminosäuren. Kürzlich wurde diese Methode in lebenden Zellen (IC-FPOP) verwendet, um Protein-Wechselwirkungen in ihrer nativen Umgebung zu untersuchen. Die Untersuchung von Proteinen in Zellen erklärt intermolekulare Überfüllung und verschiedene Protein-Wechselwirkungen, die für In-vitro-Studien gestört werden. Ein benutzerdefiniertes Einzelzell-Flow-System wurde entwickelt, um die Zellaggregation und Verstopfung während des IC-FPOP zu reduzieren. Dieses Strömungssystem fokussiert die Zellen individuell am Excimerlaser vorbei und sorgt so für eine gleichmäßige Bestrahlung. Durch den Vergleich des Ausmaßes der Oxidation, die aus FPOP erzeugt wird, mit der Lösemittelzugänglichkeit des Proteins, die aus einer Kristallstruktur berechnet wird, kann IC-FPOP die lösungsmittelzugänglichen Seitenketten von Proteinen genau untersuchen.
Hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) ist eine Methode, die die Lösemittelzugänglichkeit eines Proteins durch kovalente Modifikationen aus Hydroxylradikalen untersucht. Wenn sich die Proteinstruktur oder die Proteinwechselwirkungen ändern, wird die Slösemittelexposition von Aminosäuren verändert und somit das Ausmaß der Veränderung von Rückständen verändert. Mit HRPF wurden Protein-Wechselwirkungen1,2,3 und Protein-Konformationsveränderungen4,5,6 erfolgreich in vitro abgefragt. Es gibt mehrere Methoden, die Hydroxylradikale für HRPF-Experimente erzeugen, eine davon ist die schnelle photochemische Oxidation von Proteinen (FPOP). FPOP wurde 2005 von Hambly und Gross entwickelt und nutzt einen 248 nm Excimer-Laser zur Herstellung von Hydroxylradikalen durch die Photolyse von Wasserstoffperoxid (H2O2)7.
Kürzlich haben Espino et al. die Verwendung von FPOP erweitert, um die Proteinstruktur in lebenden Zellen zu untersuchen, eine Methode, die als in-Cell FPOP (IC-FPOP)8bezeichnet wird. Im Gegensatz zu In-vitro-Studien ist die Untersuchung von Proteinen in Zellen für molekulare Überfüllung zusammen mit verschiedenen Protein-Wechselwirkungen, die potenziell die Struktur beeinflussen könnten. Darüber hinaus bietet es den Vorteil, eine Momentaufnahme des vollständigen Proteoms bereitzustellen, das möglicherweise strukturelle Informationen von zahlreichen Systemen gleichzeitig bereitstellt, um proteomweite Strukturbiologie durchzuführen. Darüber hinaus ist diese Technik ideal für Proteine, die in vitro schwer zu untersuchen sind, wie Membranproteine.
Erste Studien von IC-FPOP untersuchten erfolgreich 105 Proteine, die in Proteinreichtum und zellulärer Lokalisierung reichen. Um die IC-FPOP-Methode zu verbessern, entwickelten Rinas et al. ein Mikroflow-System für den Einzelzellstrom9. Die Erweiterung des ursprünglichen Strömungssystems begrenzt die Zellaggregation und erhöht die für die Bestrahlung verfügbare H2O2. Im anfänglichen Strömungssystem führten Zellen, die in den Kieselsäureschläuchen verklumpen, zu Verstopfungen und ungleichmäßiger Bestrahlung. Die Einbindung von zwei Strömen eines Mantelpuffers fokussiert die Zellen hydrodynamisch, so dass sie einzeln am Laser vorbeifließen können. Die Einbindung einer separaten Spritze für die H2O2 ermöglicht eine kontrolliertere und optimierte Expositionszeit, die höhereH2O2-Konzentrationen ohne Nebenwirkungen ermöglicht. Auch die Begrenzung der Inkubationszeit begrenzt den Abbau vonH2O2 durch endogene Katasalase. Durch die Integration dieses neuen Strömungssystems erhöhte sich die nachgewiesene Anzahl von Proteinen mit einer FPOP-Modifikation um das 13-fache, wodurch die Möglichkeiten dieser Methode erweitert wurden, eine Vielzahl von Proteinen in lebenden Zellen zu untersuchen. In diesem Protokoll wird ein allgemeines IC-FPOP-Experiment beschrieben, das sich auf die Montage des IC-FPOP-Flusssystems konzentriert.
Mehrere auf Massenspektrometrie basierende Techniken wurden entwickelt, um Proteinstruktur und Protein-Ligand-Komplexe proteomweit in ganzen Zellen oder Zelllysaten zu untersuchen. Diese Techniken umfassen unter anderem die Stabilität von Proteinen aus Oxidationsgeschwindigkeit (SPROX), thermischeproteomprofilierung (TPP), chemische Vernetzung (XL-MS) und Hydroxylradikalprotein-Footprinting (HRPF). Jede Technik hat einzigartige Einschränkungen und Vorteile im Vergleich zueinander, die ausgiebig überprüft wurden12. Jede dieser Methoden wurde für proteom breite Strukturbiologie verwendet, um Proteinstruktur aufzuklären und schließlich innerhalb der komplexen zellulären Umgebung zu funktionieren. IC-FPOP ist eine HRPF-Technik, die Hydroxylradikale nutzt, um lösungsmittelexponierte Seitenketten von Aminosäuren oxidativ zu modifizieren, die Proteinstruktur und Protein-Ligand-Wechselwirkungen innerhalb lebensfähiger Zellen zu untersuchen13. IC-FPOP ist eine Verbesserung der anfänglichen HRPF in lebenden Zellen, die Fenton-Chemie verwendet, um Radikale auf der Minutenzeitskala14zu erzeugen. In dieser Studie wurden strukturelle Veränderungen in einem integralen Membranprotein als Reaktion auf die Senkung des pH- oder Ionenstärke des Puffers erfolgreich mit einer guten Oxidationsabdeckung im gesamten Protein charakterisiert. Im Vergleich zur Fenton-Chemie ist IC-FPOP viel schneller und modifizieren Proteine auf der Mikrosekunden-Zeitskala, so dass die native Proteinkonformation untersucht werden kann.
Ein wichtiger Test für IC-FPOP besteht darin, die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Exposition gegenüberH2O2zu bestätigen. Mit einer 40 cm-Mischlinie werden die Zellen in H2O2 etwa 3 s vor der Bestrahlung inkubiert. Diese Zeit kann durch Ändern der Länge dieses Kieselsäureschlauchs eingestellt werden. Es ist bemerkenswert, dass, obwohl die Verwendung von Trypan blau, um die Zelllebensfähigkeit zu testen zeigt, die Integrität der Zellen nach h2O2 Inkubation aufrechterhalten werden, die Zellen möglicherweise unter Stress-Effekt-Signalbahnen sein könnten, die mit H2O2interagieren. Glücklicherweise ist die kurze Inkubationszeit schneller als die Proteinsynthese, die Vertrauen gibt, dass die vorhandenen Proteine nicht durchH2O2induziert werden.
Der nächste wichtige Schritt besteht darin, die ordnungsgemäße Montage des Strömungssystems zu bestätigen. Stellen Sie nach der Montage sicher, dass nach dem Spülen des Systems mit dem gewünschten Puffer keine Leckagen vorhanden sind. Wenn Lecks vorhanden sind, stellen Sie sicher, dass die Kieselsäureschläuche richtig geschnitten wurden und bündig gegen die Ferrule ist, um eine richtige Dichtung zu machen, sobald sie angezogen wurde. Alle Teile sind von Hand angezogen, so dass keine Werkzeuge erforderlich sind. Stellen Sie bei jedem IC-FPOP-Experiment sicher, dass die Magnetischen Rührwerke in der Zellspritze in Bewegung bleiben. Diese kleine Agitation begrenzt die Anzahl der Zellen, die sich am Boden der Spritze absetzen, aber nicht hart genug sind, um die Zellen zu scheren. Nach einem Durchlauf sind in der Spritze noch ca. 50 l Zellen übrig. Achten Sie immer darauf, dies mit einem Spülschritt zu verdünnen, um die Anzahl der Zellen zu begrenzen, die zum nächsten Experiment übertragen werden. Es wird empfohlen, eine Frischzellenspritze zu verwenden, wenn mehrere Zellbehandlungen verglichen werden. Es ist auch wichtig, einen geeigneten Puffer für die getesteten Zellen auszuwählen. Einige Puffer löschen den Hydroxylradikal, was zu weniger Modifikationen an Proteinen führt. Xu et al. haben gezeigt, dass einige häufig verwendete Puffer die Hydroxylradikallebensdauer11verringern. DPBS und HBSS sind gängige Puffer, die für IC-FPOP-Experimente verwendet werden.
Optimieren Sie nach IC-FPOP das Verdauungsprotokoll basierend auf den erforderlichen Parametern. Da FPOP irreversible kovalente Modifikationen produziert, bleibt genügend Zeit für eine gründliche Verdauung und Reinigung, ohne die Etikettierungsabdeckung zu verlieren. Testen und normalisieren Sie die Proteinkonzentration immer, so dass gleichmäßige Peptidkonzentrationen für die Tandem-Massenspektrometrie geladen werden. Schließlich sollten Sie beachten, dass eine Immunpräzipitation nicht in Verbindung mit IC-FPOP durchgeführt werden kann. Wenn eine FPOP-Änderung auf den Interaktionsbereich abzielt, wird die Affinität des Antikörpers verringert. Um die Identifizierung von FPOP-Modifikationen zu erhöhen, haben 2D-chromatographische Trennschritte gezeigt, dass die Anzahl der oxidierten Peptide15mehr als verdreifacht hat.
Eine Herausforderung eines jeden FPOP-Experiments ist der komplizierte Grad der Datenanalyse aufgrund der möglichen Oxidationsprodukte, die entstehen können. Dies gilt sowohl für in-Zell- als auch für in vitro, wird aber mit der zusätzlichen Komplexität der Analyse von Zelllysaten drastisch erhöht. Mit der weiteren Optimierung von IC-FPOP entstehen mehr Proteine mit höheren Modifikationsabdeckungen, wodurch die Analyse beschleunigt wird. Die Schermenge an Daten, die aus einem einzigen IC-FPOP-Experiment generiert werden, schränkt die Verwendung manueller Validierung ein, wodurch sich Forscher stärker auf Software verlassen. Aus diesem Grund entwickelten Rinas et al. eine Quantifizierungsstrategie für HRPF mit Proteome Discoverer (PD)16. Diese Methode verwendet einen Workflow mit mehreren Suchknoten auf PD in Kombination mit einer quantitativen Plattform in einer Kalkulationstabelle. Weitere Verbesserungen auf der IC-FPOP-Plattform sind im Gange, um die Anzahl der identifizierten Peptide mit FPOP-Modifikationen zusammen mit erhöhter Reproduzierbarkeit und Quantifizierungsgenauigkeit zu erhöhen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch den NSF CAREER Award (MCB1701692) für LMJ unterstützt.
15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | any brand is sufficient |
500 µL SGE Gastight Syringes: Fixed Luer-Lok Models | Fisher Scientific | SG-00723 | |
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ACQUITY UPLC M-Class System | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | 04A-4299 | |
Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | EX350 excimer laser | |
FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Science | 1548L | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
Legato 210 syringe pump | KD Scientific | 788212 | Any syringe pump that can hold 4, 5 mL syringes, withdraw and expel liquid, and have a way to stale the motor should work |
Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Science | P-618L | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
N,N'-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-242X | |
NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-246 | |
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 88702 | |
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32" | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 150 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP150350 | Polymicro Technologies | 1068150024 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450 µm, Outer Diameter 670 µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150025 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel™ (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-259X | |
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Science | P-255X | |
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | PI89900 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Upchurch Scientific Low-Pressure Crosses: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-182 | |
Upchurch Scientific Low-Pressure Tees: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-178 | |
UV Fused Silica Plano-Convex Spherical Lenses | THORLABS | LA4052 | |
V&P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000 | V&P Scientific, Inc. | VP724F | |
VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Science | UH-436 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |