Qui, caratterizzamo la struttura delle proteine e i siti di interazione nelle cellule viventi utilizzando una tecnica di impronta delle proteine definita ossidazione fotochimica veloce in cell delle proteine (IC-FPOP).
L’ossidazione fotochimica rapida delle proteine (FPOP) è un metodo di impronta proteica radicale idrossile utilizzato per caratterizzare la struttura e le interazioni delle proteine. FPOP utilizza un laser ad eccimeri a 248 nm per fotolizzare il perossido di idrogeno producendo radicali idrossili. Questi radicali ossidativamente modificano solvente esposto catene laterali di 19 dei 20 aminoacidi. Recentemente, questo metodo è stato utilizzato nelle cellule vive (IC-FPOP) per studiare le interazioni proteiche nel loro ambiente nativo. Lo studio delle proteine nelle cellule spiega l’affollamento intermolecolare e varie interazioni proteiche che vengono interrotte per gli studi in vitro. Un sistema di flusso a cella singola personalizzato è stato progettato per ridurre l’aggregazione delle celle e l’intasamento durante IC-FPOP. Questo sistema di flusso concentra le cellule oltre il laser degli eccimeri individualmente, garantendo così un’irradiazione costante. Confrontando l’estensione dell’ossidazione prodotta da FPOP con l’accessibilità del solvente della proteina calcolata da una struttura cristallina, IC-FPOP può sondare con precisione le catene laterali accessibili al solvente delle proteine.
L’idrossile radical e il tureante (HRPF) sono un metodo che sonda l’accessibilità del solvente di una proteina attraverso modifiche covalenti prodotte da radicali idrossili. Quando la struttura proteica o le interazioni proteiche cambiano, altererà l’esposizione al solvente degli amminoacidi, alterando così l’entità della modificazione dei residui. Con HRPF, le interazioni proteiche1,2,3 e i cambiamenti conformazionali proteici4,5,6 sono stati interrogati con successo in vitro. Ci sono diversi metodi che generano radicali idrossili per esperimenti HRPF, uno dei quali è l’ossidazione fotochimica veloce delle proteine (FPOP). FPOP è stato sviluppato da Hambly e Gross nel 2005 e utilizza un laser ad eccimeri 248 nm per produrre radicali idrossili attraverso la fotolisi del perossido di idrogeno (H2O2)7.
Recentemente, Espino et al. ha esteso l’uso di FPOP per sondare la struttura delle proteine nelle cellule vive, un metodo chiamato FPOP in-cell (IC-FPOP)8. A differenza degli studi in vitro, lo studio delle proteine nelle cellule spiega l’affollamento molecolare insieme a varie interazioni proteiche che potrebbero potenzialmente influenzare la struttura. Inoltre, presenta il vantaggio di fornire un’istantanea dell’intero proteoma potenzialmente fornendo informazioni strutturali di numerosi sistemi contemporaneamente per eseguire la biologia strutturale larga proteoma. Inoltre, questa tecnica è ideale per proteine difficili da studiare in vitro, come le proteine della membrana.
Gli studi iniziali dell’IC-FPOP hanno sondato con successo 105 proteine che vanno in abbondanza di proteine e localizzazione cellulare. Per migliorare il metodo IC-FPOP, Rinas e altri hanno sviluppato un sistema di microflusso per il flusso a cella singola9. Il miglioramento del sistema di flusso originale limita l’aggregazione delle cellule e aumenta l’H2O2 disponibile disponibile per l’irradiazione. Nel sistema di flusso iniziale, le cellule che si acmassano nel tubo di silice hanno provocato ostriche e irradiazione irregolare. L’incorporazione di due flussi di un tampone di guaina concentra idrodinamicamente le cellule, permettendo loro di fluire individualmente oltre il laser. L’incorporazione di una siringa separata per l’H2O2 consente un tempo di esposizione più controllato e ottimizzabile che consente concentrazioni più elevate di H2O2 senza effetti negativi. Inoltre, limitando il tempo di incubazione limita la ripartizione di H2O2 da catalasi endogena. Incorporando questo nuovo sistema di flusso, il numero rilevato di proteine con una modifica FPOP è aumentato di 13 volte, espandendo così le capacità di questo metodo per sondare una moltitudine di proteine nelle cellule viventi. In questo protocollo viene descritto un esperimento generale IC-FPOP incentrato sull’assemblaggio del sistema di flusso IC-FPOP.
Diverse tecniche basate sulla spettrometria di massa sono state sviluppate per studiare la struttura delle proteine e i complessi proteina-ligando in modo diffuso su proteoma in cellule intere o lismi cellulari. Queste tecniche includono, a dire, non si limitano alla stabilità delle proteine derivanti dal tasso di ossidazione (SPROX), alla profilazione termica del proteoma (TPP), al collegamento chimico incrociato (XL-MS) e all’impronta delle proteine radicali degli idrossili (HRPF). Ogni tecnica ha limitazioni e vantaggi unici l’uno rispetto all’altro, che sono stati ampiamente rivisti12. Ognuno di questi metodi è stato utilizzato per la biologia strutturale larga proteoma per chiarire la struttura delle proteine e, in ultima analisi, funzionare all’interno del complesso ambiente cellulare. IC-FPOP è una tecnica HRPF che utilizza i radicali idrossili per modificare ossidativamente catene laterali esposte solventi di aminoacidi, sondando la struttura delle proteine e proteine-ligand oleosse all’interno di cellule vitali13. IC-FPOP è un miglioramento all’HRPF iniziale nelle cellule vive che hanno utilizzato la chimica del Fenton per generare radicali sulla scala cronologica dei minuti14. In questo studio, i cambiamenti strutturali in una proteina membrana integrale in risposta all’abbassamento del pH o della forza ionica del buffer sono stati caratterizzati con successo con una buona copertura di ossidazione in tutta la proteina. Rispetto alla chimica del Fenton, l’IC-FPOP è molto più veloce, modificando le proteine sulla scala temporale di microsecondi, consentendo così di studiare la conformazione delle proteine native.
Un test chiave per IC-FPOP è quello di confermare la vitalità delle cellule dopo l’esposizione a H2O2. Utilizzando una linea di miscelazione di 40 cm, le cellule vengono incubate in H2O2 per circa 3 s prima dell’irradiazione. Questo tempo può essere regolato cambiando la lunghezza di questo tubo di silice. È interessante notare che, sebbene l’uso di trypan blue per testare la vitalità cellulare dimostri che l’integrità delle cellule è sostenuta dopo l’incubazione di H2O2, le cellule potrebbero essere potenzialmente sotto stress effettuando percorsi di segnalazione che interagiscono con H2O2. Fortunatamente, il breve tempo di incubazione è più veloce della sintesi proteica fornendo fiducia le proteine presenti non sono indotte da H2O2.
Il passo successivo importante è quello di confermare il corretto assemblaggio del sistema di flusso. Una volta assemblato, assicurarsi che non siano presenti perdite dopo aver svuotato il sistema con il buffer desiderato. Se sono presenti perdite, assicurarsi che il tubo di silice è stato tagliato correttamente e viene a filo contro il ferrule per fare una corretta guarnizione una volta stretto verso il basso. Tutte le parti sono serrate a mano, quindi non sono necessari utensili. Durante ogni esperimento IC-FPOP, assicurarsi che gli agitatori magnetici nella siringa cellulare rimangano in movimento. Questa piccola agitazione limita il numero di cellule che si depositano nella parte inferiore della siringa, ma non è abbastanza dura per shearlare le cellule. Dopo una corsa, nella siringa rimane circa 50 gradi di cellule. Assicurati sempre di diluire questo con un passo di risciacquo per limitare il numero di cellule che portano all’esperimento successivo. Si consiglia di utilizzare una siringa a cellule fresche se vengono confrontati più trattamenti cellulari. È inoltre importante selezionare un buffer appropriato per le celle sottoposte a test. Alcuni tamponi placano il radicale idrossile portando a meno modifiche sulle proteine. Xu et al. hanno dimostrato che alcuni buffer comunemente utilizzati diminuiscono la vita radicale idrossile11. DPBS e HBSS sono buffer comuni utilizzati per gli esperimenti IC-FPOP.
Dopo IC-FPOP, ottimizzare il protocollo di digestione in base ai parametri necessari. Poiché l’FPOP produce modifiche covalenti irreversibili, c’è molto tempo a disposizione per una digestione e pulizia approfondita senza perdere la copertura di etichettatura. Testate sempre e normalizzare la concentrazione proteica in modo che concentrazioni di peptidi uniformi vengano caricate per la spettrometria di massa in tandem. Infine, tenere presente che un’immunoprecipitazioni non può essere eseguita in combinazione con IC-FPOP. Se una modifica FPOP è destinata all’area di interazione, l’affinità dell’anticorpo verrà abbassata. Per contribuire ad aumentare l’identificazione delle modifiche FPOP, i passaggi di separazione 2D-cromatografica hanno dimostrato di più che triplicare il numero di peptidi ossidati rilevati15.
Una sfida di qualsiasi esperimento FPOP è il complicato livello di analisi dei dati dovuto ai possibili prodotti di ossidazione che possono sorgere. Questo è vero sia per la cella o in vitro, ma è drasticamente aumentato con l’ulteriore complessità di analizzare le lisate cellulari. Con un’ulteriore ottimizzazione di Un numero maggiore di proteine IC-FPOP con coperture di modificazione più elevate, rendendo così rapidamente l’analisi più ardua. La quantità di taglio dei dati generati da un singolo esperimento IC-FPOP limita l’uso della convalida manuale, inducendo i ricercatori a fare più affidamento sul software. Per questo motivo, Rinas e altri hanno sviluppato una strategia di quantificazione per HRPF utilizzando Proteome Discoverer (PD)16. Questo metodo utilizza un flusso di lavoro di nodo multi-ricerca su PD combinato con una piattaforma quantitativa in un foglio di calcolo. Ulteriori miglioramenti sulla piattaforma IC-FPOP sono in corso per aumentare il numero di peptidi identificati con modifiche FPOP insieme a una maggiore riproducibilità e precisione di quantificazione.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal NSF CAREER Award (MCB1701692) per LMJ.
15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | any brand is sufficient |
500 µL SGE Gastight Syringes: Fixed Luer-Lok Models | Fisher Scientific | SG-00723 | |
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ACQUITY UPLC M-Class System | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | 04A-4299 | |
Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | EX350 excimer laser | |
FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Science | 1548L | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
Legato 210 syringe pump | KD Scientific | 788212 | Any syringe pump that can hold 4, 5 mL syringes, withdraw and expel liquid, and have a way to stale the motor should work |
Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Science | P-618L | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
N,N'-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-242X | |
NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-246 | |
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 88702 | |
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32" | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 150 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP150350 | Polymicro Technologies | 1068150024 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450 µm, Outer Diameter 670 µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150025 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel™ (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-259X | |
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Science | P-255X | |
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | PI89900 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Upchurch Scientific Low-Pressure Crosses: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-182 | |
Upchurch Scientific Low-Pressure Tees: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-178 | |
UV Fused Silica Plano-Convex Spherical Lenses | THORLABS | LA4052 | |
V&P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000 | V&P Scientific, Inc. | VP724F | |
VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Science | UH-436 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |