शारीरिक परिस्थितियों में स्लाइसिंग और सुअर दिलों को संजोना
Summary
यह प्रोटोकॉल 6 दिनों के लिए शारीरिक परिस्थितियों के तहत दिल के ऊतकों को कैसे स्लाइस और संस्कृति का वर्णन करता है। इस संस्कृति प्रणाली का उपयोग उपन्यास हृदय विफलता चिकित्सीय की प्रभावकारिता के साथ-साथ 3 डी हृदय मॉडल में तीव्र कार्डियोटॉक्सिसिटी के विश्वसनीय परीक्षण के परीक्षण के लिए एक मंच के रूप में किया जा सकता है।
Abstract
कई उपन्यास दवाओं नैदानिक अध्ययन में कार्डियोटॉक्सिक साइड इफेक्ट के कारण विफल के रूप में वर्तमान में विट्रो assays में उपलब्ध है और वीवो पशु मॉडल में खराब मानव हृदय देनदारियों की भविष्यवाणी, दवा उद्योग पर एक बहु अरब डॉलर का बोझ प्रस्तुत । इसलिए, महंगा और समय लेने वाले ‘ आदमी में पहले ‘ परीक्षणों से पहले दवा कार्डियोटॉक्सिसिटी की पहचान करने के लिए बेहतर दृष्टिकोण के लिए दुनिया भर में अपूरित चिकित्सा की जरूरत है । वर्तमान में, केवल अपरिपक्व हृदय कोशिकाओं (मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स [hiPSC-सीएम]) चिकित्सकीय दक्षता और दवा विषाक्तता का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जाता है क्योंकि वे केवल मानव हृदय कोशिकाओं है कि लंबे समय के लिए संस्कारी किया जा सकता है दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है। हालांकि, एक भी सेल प्रकार जटिल 3डी हृदय ऊतक के फेनोटाइप को दोहराने नहीं दे सकता है जो कई कोशिका प्रकारों से बनता है। महत्वपूर्ण बात, दवाओं के प्रभाव को वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स पर परीक्षण करने की आवश्यकता है, जिनमें अपरिपक्व hiPSC-सीएमएस की तुलना में विभिन्न विशेषताएं और विषाक्तता प्रतिक्रियाएं हैं । मानव दिल स्लाइस की खेती बरकरार मानव मायोकार्डियम का एक आशाजनक मॉडल है । यह तकनीक एक पूर्ण बहुकोशिकीय प्रणाली तक पहुंच प्रदान करती है जो मानव हृदय ऊतक की नकल करती है और मानव मायोकार्डियम की शारीरिक या रोग की स्थितियों को दर्शाती है। हाल ही में, संस्कृति मीडिया घटकों के अनुकूलन और संस्कृति की स्थिति के माध्यम से १.२ हर्ट्ज पर निरंतर विद्युत उत्तेजना और संस्कृति माध्यम के आंतरायिक ऑक्सीजन शामिल करने के लिए, हम एक नई संस्कृति प्रणाली सेटअप है कि व्यवहार्यता को बरकरार रखता है विकसित और संस्कृति में 6 दिनों के लिए मानव और सुअर दिल स्लाइस की कार्यक्षमता। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम एक उदाहरण के रूप में सुअर दिल को टुकड़ा करने और सफ़ाई करने के लिए विधि का ब्यौरा दे रहे हैं। एक ही प्रोटोकॉल मानव, कुत्ते, भेड़, या बिल्ली दिल से स्लाइस संस्कृति के लिए प्रयोग किया जाता है। इस संस्कृति प्रणाली में तीव्र कार्डियोटॉक्सिकिसिटी परीक्षण के लिए सीटू मॉडल में एक शक्तिशाली भविष्य कहनेवाला मानव बनने की क्षमता है जो प्रीक्लिनिकल और नैदानिक परीक्षण परिणामों के बीच के अंतर को बंद कर देता है।
Introduction
दवा प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी बाजार वापसी का एक प्रमुख कारण है1। 20वीं शताब्दी के अंतिम दशक में, आठ गैर-हृदय दवाओं को बाजार से वापस ले लिया गया क्योंकि वे वेंट्रिकुलर अतालता2के कारण अचानक मृत्यु हो गई। इसके अलावा, कई कैंसर विरोधी उपचार (जबकि कई मामलों में प्रभावी) कार्डियोमायोपैथी और अतालता सहित कई कार्डियोटॉक्सिक प्रभाव का कारण बन सकते हैं। उदाहरण के लिए, पारंपरिक (उदाहरण के लिए, एंथ्रसाइक्लिन और विकिरण) और लक्षित (जैसे, ट्रैस्टुमुमेब) स्तन कैंसर उपचार ों के परिणामस्वरूप रोगियों के सबसेट में हृदय संबंधी जटिलताएं हो सकती हैं3। हृदय रोग विशेषज्ञों और ऑन्कोलॉजिस्ट के बीच एक घनिष्ठ सहयोग (कार्डियो-ऑन्कोलॉजी” के उभरते क्षेत्र के माध्यम से) ने इन जटिलताओं को प्रबंधनीय बनाने में मदद की है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि रोगियों का प्रभावी ढंग से इलाज किया जा सकताहै। कम स्पष्ट Her2 और PI3K अवरोधकों सहित नए एजेंटों के हृदय प्रभाव हैं, खासकर जब उपचार संयोजन में उपयोग किया जाता है । इसलिए, मानव नैदानिक परीक्षणों से पहले उभरते कैंसर विरोधी उपचारों से जुड़े हृदय विषाक्तता के लिए विश्वसनीय प्रीक्लिनिकल स्क्रीनिंग रणनीतियों की आवश्यकता बढ़ रही है। मानव हृदय ऊतक के लिए संस्कृति प्रणालियों की उपलब्धता की कमी जो 24 घंटे से अधिक के लिए कार्यात्मक और संरचनात्मक रूप से व्यवहार्य है, विश्वसनीय कार्डियोटॉक्सिकिटी परीक्षण के लिए एक सीमित कारक है। इसलिए, दवा विषाक्तता के परीक्षण के लिए शारीरिक परिस्थितियों में मानव हृदय ऊतक को सत्कार करने के लिए एक विश्वसनीय प्रणाली विकसित करने की तत्काल आवश्यकता है।
कार्डियोटॉक्सिकिटी टेस्टिंग में मानव प्रेरित प्लुरिटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (hiPSC-सीएम) के उपयोग की दिशा में हाल ही में किए गए कदम ने इस मुद्दे के समाधान के लिए एक आंशिक समाधान प्रदान किया है; हालांकि, hiPSC-सीएम की अपरिपक्व प्रकृति और दिल के ऊतकों की बहुकोशिकीय प्रकृति की तुलना में ऊतक अखंडता के नुकसान इस तकनीक4की प्रमुख सीमाएं हैं । हाल के एक अध्ययन ने हाइड्रोगेल पर एचआईपीएससी-सीएम से हृदय ऊतकों के निर्माण के माध्यम से इस सीमा को आंशिक रूप से दूर किया है और उन्हें समय5के साथ विद्युत उत्तेजना में क्रमिक वृद्धि के अधीन किया है। हालांकि, उनके विद्युत गुणों ने वयस्क मानव मायोकार्डियम में देखी गई परिपक्वता को प्राप्त नहीं किया। इसके अलावा, दिल के ऊतक संरचनात्मक रूप से अधिक जटिल हैं, विभिन्न सेल प्रकारों से बने हैं, जिनमें एंडोथेलियल कोशिकाएं, न्यूरॉन्स और विभिन्न प्रकार के स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट शामिल हैं जो एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन6के एक बहुत ही विशिष्ट मिश्रण के साथ जुड़े हुए हैं। वयस्क स्तनधारी हृदय में गैर-कार्डियोमायोसाइट सेल जनसंख्या7,8,8,9 की यह विषमता व्यक्तिगत कोशिका प्रकारों का उपयोग करके हृदय ऊतक मॉडलिंग में एक बड़ी बाधा है। ये प्रमुख सीमाएं हृदय5की शारीरिक और रोग की स्थितियों से जुड़े इष्टतम अध्ययनों के लिए अक्षत हृदय ऊतक की संस्कृति को सक्षम बनाने के लिए तरीकों के विकास के महत्व को उजागर करती हैं ।
मानव हृदय स्लाइस की डली बरकरार मानव मायोकार्डियम का एक आशाजनक मॉडल है। यह तकनीक एक पूर्ण 3 डी बहुकोशिकीय प्रणाली तक पहुंच प्रदान करती है जो मानव हृदय ऊतक के समान है जो मानव मायोकार्डियम की शारीरिक या रोग की स्थितियों को मज़बूती से प्रतिबिंबित कर सकती है। हालांकि, इसका उपयोग संस्कृति में व्यवहार्यता की छोटी अवधि से गंभीर रूप से सीमित हो गया है, जो 201810,,11,,12तक सूचित सबसे मजबूत प्रोटोकॉल का उपयोग करके 24 घंटे से आगे नहीं बढ़ता है। यह सीमा स्लाइस संस्कृति के लिए हवा तरल इंटरफेस के उपयोग सहित कई कारकों के कारण थी, और एक सरल संस्कृति माध्यम का उपयोग जो हृदय ऊतक की उच्च ऊर्जावान मांगों का समर्थन नहीं करता है। हमने हाल ही में एक जलमग्न संस्कृति प्रणाली विकसित की है जो निरंतर विद्युत उत्तेजना प्रदान करने में सक्षम है और 6 दिनों तक13तक हृदय ऊतक ों के स्लाइस को व्यवहार्य रखने के लिए संस्कृति मीडिया घटकों को अनुकूलित करती है । इस संस्कृति प्रणाली में प्रीक्लिनिकल और नैदानिक परीक्षण परिणामों के बीच के अंतर को बंद करने के लिए तीव्र कार्डियोटॉक्सिकिसिटी परीक्षण के लिए सीटू मॉडल में एक शक्तिशाली भविष्य कहनेवाला मानव बनने की क्षमता है। वर्तमान लेख में, हम एक उदाहरण के रूप में एक सुअर दिल का उपयोग कर दिल स्लाइस टुकड़ा करने की क्रिया और तत्यापन के लिए प्रोटोकॉल का ब्यौरा दे रहे हैं । यही प्रक्रिया मानव, कुत्ते, भेड़ या बिल्ली के दिलों पर लागू होती है। इस प्रोटोकॉल के साथ हम वैज्ञानिक समुदाय की अन्य प्रयोगशालाओं में तकनीक फैलाने की उम्मीद कर रहे हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम सरलीकृत माध्यम थ्रूपुट (४८ स्लाइस/डिवाइस तक की प्रक्रियाओं) विधि के लिए हमारी हाल ही में प्रकाशित विधि के लिए विस्तृत वीडियो प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो तीव्र कार्डियोटॉक्सिसिटी13?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
टीएमएएम को एनआईएच ग्रांट पी30जीएम 127607 और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन ग्रांट 16SDG29950012 का समर्थन है। आरबी P01HL78825 और UM1HL113530 द्वारा समर्थित है ।
Materials
| 1000ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks – | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
- Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10 (2016).
- Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
- Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
- Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
- Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).
- Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).
- Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).
