Method Article

Découper et cultiver des cœurs de porc dans des conditions physiologiques

DOI:

10.3791/60913

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March 20th, 2020

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1Institute of Molecular Cardiology, Department of Medicine, University of Louisville, 2Department of Bioengineering, University of Louisville, 3Diabetes and Obesity Center, Department of Medicine, University of Louisville, 4Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 5Institute of Cardiovascular Sciences, University of Manchester, 6Faculty of Pharmacy, Zagazig University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit comment trancher et culturer le tissu cardiaque dans des conditions physiologiques pendant 6 jours. Ce système de culture pourrait être utilisé comme une plate-forme pour tester l’efficacité de nouvelles thérapies d’insuffisance cardiaque ainsi que des tests fiables de cardiotoxicité aigue dans un modèle cardiaque 3D.

Abstract

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De nombreux nouveaux médicaments échouent dans les études cliniques en raison d’effets secondaires cardiotoxiques que les essais in vitro actuellement disponibles et les modèles animaux in vivo mal prédire les responsabilités cardiaques humaines, posant un fardeau de plusieurs milliards de dollars sur l’industrie pharmaceutique. Par conséquent, il existe un besoin médical non satisfait dans le monde entier de meilleures approches pour identifier la cardiotoxicité des médicaments avant d’entreprendre des essais coûteux et longs « d’abord chez l’homme ». À l’heure actuelle, seules les cellules cardiaques immatures (cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme [hiPSC-CMs]) sont utilisées pour tester l’efficacité thérapeutique et la toxicité des médicaments, car elles sont les seules cellules cardiaques humaines qui peuvent être cultivées pendant de longues périodes. pour tester l’efficacité et la toxicité des médicaments. Cependant, un type de cellule unique ne peut pas reproduire le phénotype du tissu cardiaque 3D complexe qui est formé de plusieurs types de cellules. Fait important, l’effet des médicaments doit être testé sur les cardiomyocytes adultes, qui ont des caractéristiques différentes et des réponses de toxicité par rapport aux hélico-CM immatures. Culturing tranches cardiaques humaines est un modèle prometteur de myocarde humain intact. Cette technologie donne accès à un système multicellulaire complet qui imite le tissu cardiaque humain et reflète les conditions physiologiques ou pathologiques du myocarde humain. Récemment, grâce à l’optimisation des composantes des médias culturels et des conditions de culture pour inclure la stimulation électrique continue à 1,2 Hz et l’oxygénation intermittente du milieu de la culture, nous avons développé une nouvelle configuration du système culturel qui préserve la viabilité et la fonctionnalité des tranches de cœur humain et porcine pendant 6 jours dans la culture. Dans le protocole actuel, nous détail faisons part de la méthode de découpe et de culture du cœur de porc. Le même protocole est utilisé pour la culture des tranches de cœurs humains, de chiens, de moutons ou de chats. Ce système de culture a le potentiel de devenir un puissant modèle prédictif in situ humain pour les tests de cardiotoxicité aigu qui comble l’écart entre les résultats des tests précliniques et cliniques.

Introduction

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La cardiotoxicité induite par la drogue est une cause majeure de retrait du marché1. Dans la dernière décennie du 20e siècle, huit médicaments non-cardiovasculaires ont été retirés du marché car ils ont entraîné la mort subite due à des arythmies ventriculaires2. En outre, plusieurs thérapies anticancéreuses (bien que dans de nombreux cas efficaces) peuvent conduire à plusieurs effets cardiotoxiques, y compris la cardiomyopathie et les arythmies. Par exemple, les thérapies traditionnelles (p. ex., anthracyclines et rayonnement) et les traitements ciblés (p. ex., trastuzumab) du cancer du sein peuvent entraîner....

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Protocol

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Toutes les procédures animales étaient conformes aux lignes directrices institutionnelles de l’Université de Louisville et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.

1. Préparation pour le tranchage (Un jour avant le tranchage)

  1. Préparation du microtome vibrant
    1. Placez la lame en céramique dans son support en suivant ces étapes : après avoir soigneusement déballé la lame, placez le bord tranchant en premier dans la fente de l’outil de lame. Ensuite, placez la lame dans le support en desserrant les deux vis sur les bras du support et faites glisser la lame sous chaque lav....

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Results

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À l’aide d’un stimulateur électrique de culture cellulaire disponible dans le commerce qui peut accueillir huit 6 plaques de puits à la fois, nous avons imité le milieu cardiaque adulte en induisant la stimulation électrique à la fréquence physiologique (1,2 Hz), et examiné pour les composants moyens fondamentaux pour prolonger la durée des tranches fonctionnelles de coeur de porc dans la culture13. Puisque le porc et les coeurs humains sont semblables dans la tail.......

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Discussion

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Ici, nous décrivons le protocole vidéo détaillé pour notre méthode récemment publiée pour le débit moyen simplifié (processus jusqu’à 48 tranches / dispositif) méthode qui permet la culture des tranches de cœur de porc pour une période suffisamment longue pour tester la cardiotoxicité aigue13. Les conditions proposées imitent l’environnement du cœur, y compris la fréquence de stimulation électrique, la disponibilité des nutriments et l’oxygénation intermittente. Nous attribuons la viabilité prolon.......

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Disclosures

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TMAM détient des participations dans Tenaya Therapeutics. Les autres auteurs ne rapportent aucun conflit.

Acknowledgements

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TMAM est soutenu par la subvention des NIH P30GM127607 et la subvention de l’American Heart Association 16SDG29950012. RB est soutenu par P01HL78825 et UM1HL113530.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 000 ml, 0,22 et micro ; m, Systèmes de filtration/stockage sous videVWR28199-812
2,3-Butanedione monoxime (BDM)FisherAC150375000
500 mL, 0,22 & micro ; m, Filtre à vide/Systèmes de stockageVWR28199-788
Couvercle de parabole C à 6 puits (couvercle de plaque de stimulation électrique)Ion OptixCLD6WFC
Plaques à 6 puitsFisher08-772-1B
AgaroseBioline USABIO-41025
Antibiotique-AntimycotiqueThermo15-240-062
C-Pace EM ( Ion OptixCEP100
Chlorure de calcium (CaCl2)FisherC79-500
Lames en céramique pour microtome vibrantCampden Instruments7550-1-C
Cooley Chest RetractorMillennium Surgical63-G5623
D-GlucoseFisherD16-1
Scalpel jetable #20Biologyproducts.comDS20X
Falcon Cell Strainers, stérile, CorningVWR21008-952
Sérum de veau fœtalThermoA3160502
Graefe ForcepsFisherNC9475675
Héparine sel sodiqueSigma-AldrichH3149-50KU
HEPESFisherBP310-1
Histoacryl BLUE Colle à tissuAmazonhttps://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/
Iris Ciseaux à ressortFisherNC9019530
Iris CiseauxdroitsFisher731210
Isoflurane, USPPiramalNDC 66794-017-25
ITS Supplément de milieu liquideSigma-AldrichI3146-5ML
Kétamine HCl (500 mg/10 mL)West-WardNDC 0143-9508
Chlorure de magnésium (MgCl2)FisherM33-500
Mayo SuperCut CiseauxchirurgicauxAROSurgical Instruments CorporationAROSuperCut&trade ; 07.164.17
Medium 199, Earle’s SaltsThermo11-150-059
Régulateur d’oxygènePraxair
Réservoirs d’oxygène -Praxair
Pipettes Pasteur en plastiqueFisher13-711-48
Chlorure de potassium (KCl)Fisher
Imprimante Distribution CourroieAmazonhttps://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/
Lames rectangulaires de rasoirFisher12-640
Recombinant Human FGF basicR& D Systems233-FB-025/CF
VEGF humain recombinantR& D Systems293-VE-010/CF
Scalpels rétractablesFisher22-079-716
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)FisherAC217125000
Chlorure de sodium (NaCl)FisherAC327300010
Microtome vibrantCampden Instruments7000 SMZ-2
Xylazine HCl (100 mg/mL)Approvisionnement vétérinaire HeartlandNADA 139-236
AC193780010

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10(2016).
  2. Fermini, B., Fossa, A. A.

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