Découper et cultiver des cœurs de porc dans des conditions physiologiques
Summary
Ce protocole décrit comment trancher et culturer le tissu cardiaque dans des conditions physiologiques pendant 6 jours. Ce système de culture pourrait être utilisé comme une plate-forme pour tester l’efficacité de nouvelles thérapies d’insuffisance cardiaque ainsi que des tests fiables de cardiotoxicité aigue dans un modèle cardiaque 3D.
Abstract
De nombreux nouveaux médicaments échouent dans les études cliniques en raison d’effets secondaires cardiotoxiques que les essais in vitro actuellement disponibles et les modèles animaux in vivo mal prédire les responsabilités cardiaques humaines, posant un fardeau de plusieurs milliards de dollars sur l’industrie pharmaceutique. Par conséquent, il existe un besoin médical non satisfait dans le monde entier de meilleures approches pour identifier la cardiotoxicité des médicaments avant d’entreprendre des essais coûteux et longs « d’abord chez l’homme ». À l’heure actuelle, seules les cellules cardiaques immatures (cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme [hiPSC-CMs]) sont utilisées pour tester l’efficacité thérapeutique et la toxicité des médicaments, car elles sont les seules cellules cardiaques humaines qui peuvent être cultivées pendant de longues périodes. pour tester l’efficacité et la toxicité des médicaments. Cependant, un type de cellule unique ne peut pas reproduire le phénotype du tissu cardiaque 3D complexe qui est formé de plusieurs types de cellules. Fait important, l’effet des médicaments doit être testé sur les cardiomyocytes adultes, qui ont des caractéristiques différentes et des réponses de toxicité par rapport aux hélico-CM immatures. Culturing tranches cardiaques humaines est un modèle prometteur de myocarde humain intact. Cette technologie donne accès à un système multicellulaire complet qui imite le tissu cardiaque humain et reflète les conditions physiologiques ou pathologiques du myocarde humain. Récemment, grâce à l’optimisation des composantes des médias culturels et des conditions de culture pour inclure la stimulation électrique continue à 1,2 Hz et l’oxygénation intermittente du milieu de la culture, nous avons développé une nouvelle configuration du système culturel qui préserve la viabilité et la fonctionnalité des tranches de cœur humain et porcine pendant 6 jours dans la culture. Dans le protocole actuel, nous détail faisons part de la méthode de découpe et de culture du cœur de porc. Le même protocole est utilisé pour la culture des tranches de cœurs humains, de chiens, de moutons ou de chats. Ce système de culture a le potentiel de devenir un puissant modèle prédictif in situ humain pour les tests de cardiotoxicité aigu qui comble l’écart entre les résultats des tests précliniques et cliniques.
Introduction
La cardiotoxicité induite par la drogue est une cause majeure de retrait du marché1. Dans la dernière décennie du 20e siècle, huit médicaments non-cardiovasculaires ont été retirés du marché car ils ont entraîné la mort subite due à des arythmies ventriculaires2. En outre, plusieurs thérapies anticancéreuses (bien que dans de nombreux cas efficaces) peuvent conduire à plusieurs effets cardiotoxiques, y compris la cardiomyopathie et les arythmies. Par exemple, les thérapies traditionnelles (p. ex., anthracyclines et rayonnement) et les traitements ciblés (p. ex., trastuzumab) du cancer du sein peuvent entraîner des complications cardiovasculaires chez un sous-ensemble de patients3. Une étroite collaboration entre les cardiologues et les oncologues (via le domaine émergent de la « cardio-oncologie ») a contribué à rendre ces complications gérables en veillant à ce que les patients puissent être traités efficacement2. Les effets cardiovasculaires des nouveaux agents sont moins clairs, y compris les inhibiteurs Her2 et PI3K, surtout lorsque les thérapies sont utilisées en combinaison. Par conséquent, il existe un besoin croissant de stratégies de dépistage précliniques fiables pour les toxicités cardiovasculaires associées aux thérapies anticancéreuses émergentes avant les essais cliniques humains. Le manque de disponibilité des systèmes de culture pour les tissus cardiaques humains qui est fonctionnellement et structurellement viable pour plus de 24 h est un facteur limitant pour des tests de cardiotoxicité fiables. Par conséquent, il est urgent de développer un système fiable pour la culture des tissus cardiaques humains dans des conditions physiologiques pour tester la toxicité des médicaments.
Le récent mouvement vers l’utilisation de cardiomyocytes pluripotents induits par les cellules souches induites par l’homme (smS-h) dans les tests de cardiotoxicité a fourni une solution partielle pour résoudre ce problème; cependant, la nature immature des hiPSC-CMs et la perte d’intégrité tissulaire par rapport à la nature multicellulaire du tissu cardiaque sont des limites majeures de cette technologie4. Une étude récente a partiellement surmonté cette limitation par la fabrication de tissus cardiaques à partir de hiPSC-CMs sur les hydrogels et les soumettant à une augmentation progressive de la stimulation électrique au fil du temps5. Cependant, leurs propriétés électromécaniques n’ont pas atteint la maturité vue dans le myocarde humain adulte. En outre, le tissu cardiaque est structurellement plus compliqué, étant composé de divers types de cellules, y compris les cellules endothéliales, les neurones et divers types de fibroblastes stromal liés avec un mélange très spécifique de protéines de matrice extracellulaire6. Cette hétérogénéité de la population cellulaire non cardiomyocyte7,8,9 dans le cœur adulte de mammifères est un obstacle majeur dans la modélisation des tissus cardiaques en utilisant des types individuels de cellules. Ces limitations majeures soulignent l’importance de développer des méthodes pour permettre la culture du tissu cardiaque intact pour des études optimales impliquant des conditions physiologiques et pathologiques du cœur5.
La culture des tranches de cœur humain est un modèle prometteur de myocarde humain intact. Cette technologie donne accès à un système multicellulaire 3D complet qui est similaire au tissu cardiaque humain qui pourrait refléter de façon fiable les conditions physiologiques ou pathologiques du myocarde humain. Cependant, son utilisation a été sévèrement limitée par la courte période de viabilité dans la culture, qui ne s’étend pas au-delà de 24 h en utilisant les protocoles les plus robustes signalés jusqu’en 201810,11,12. Cette limitation était due à de multiples facteurs, y compris l’utilisation de l’interface air-liquide pour la culture des tranches, et l’utilisation d’un simple milieu de culture qui ne supporte pas les exigences énergétiques élevées du tissu cardiaque. Nous avons récemment développé un système de culture submergé qui est en mesure de fournir une stimulation électrique continue et optimisé les composants des médias de la culture pour garder les tranches de tissu cardiaque viables pour un jusqu’à 6 jours13. Ce système de culture a le potentiel de devenir un puissant modèle prédictif in situ humain pour les tests de cardiotoxicité aigus pour combler l’écart entre les résultats précliniques et cliniques d’essais. Dans l’article actuel, nous détaillant le protocole pour trancher et se poursier les tranches de coeur à l’aide d’un cœur de porc à titre d’exemple. Le même processus s’applique aux cœurs humains, aux chiens, aux moutons ou aux chats. Avec ce protocole, nous espérons diffuser la technologie à d’autres laboratoires de la communauté scientifique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous décrivons le protocole vidéo détaillé pour notre méthode récemment publiée pour le débit moyen simplifié (processus jusqu’à 48 tranches / dispositif) méthode qui permet la culture des tranches de cœur de porc pour une période suffisamment longue pour tester la cardiotoxicité aigue13. Les conditions proposées imitent l’environnement du cœur, y compris la fréquence de stimulation électrique, la disponibilité des nutriments et l’oxygénation intermittente. Nous attr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMAM est soutenu par la subvention des NIH P30GM127607 et la subvention de l’American Heart Association 16SDG29950012. RB est soutenu par P01HL78825 et UM1HL113530.
Materials
| 1000ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks – | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
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