生理学的条件下での豚の心臓のスライスと培養
Summary
このプロトコルは、6日間の生理学的条件下で心臓組織をスライスおよび培養する方法を説明する。この培養システムは、3D心臓モデルにおける急性心毒性の信頼性の高いテストと同様に、新しい心不全治療薬の有効性をテストするためのプラットフォームとして使用することができる。
Abstract
多くの新薬は、現在入手可能な体外アッセイや生体内動物モデルが人間の心臓負債を十分に予測できず、製薬業界に数十億ドルの負担をかけているため、心毒性の副作用のために臨床研究に失敗する。したがって、高価で時間のかかる「人間の最初の」試験を行う前に、薬物の心毒性を特定するためのより良いアプローチのための世界的な満たされていない医療ニーズがあります。現在、未熟な心臓細胞(ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM))のみが、長期間培養できる唯一のヒト心臓細胞であるため、治療効率と薬物毒性を試験するために使用されている。薬効と毒性をテストするために必要.しかし、単一の細胞型は、複数の細胞型で形成される複雑な3D心臓組織の表現型を複製することはできません。重要なことに、薬物の効果は、未熟なhiPSC-CMsと比較して異なる特性および毒性応答を有する成人心筋細胞に対して試験する必要がある。この技術は、人間の心臓組織を模倣し、ヒト心筋の生理学的または病理学的状態を反映する完全な多細胞システムへのアクセスを提供する。近年、培養培地成分の最適化と培養条件の最適化により、1.2Hzでの連続的な電気刺激及び培養培地の間欠酸素化を含み、生存率を維持する新しい培養システムのセットアップを開発しました。人間と豚の心臓スライスの機能性は、文化の中で6日間。現在のプロトコルでは、例として豚の心臓をスライスし、培養するための方法を詳述しています。同じプロトコルは、人間、犬、羊、または猫の心からのスライスを培養するために使用されます。この培養システムは、前臨床と臨床検査の結果の間のギャップを閉じる急性心毒性試験のための現場モデルで強力な予測ヒトになる可能性を秘めています。
Introduction
薬物誘発性心毒性は、市場撤退の主な原因である 1.20世紀の最後の10年間で、8つの非心血管薬が心室性不整脈2によって突然死したため、市場から撤退した。さらに、いくつかの抗癌療法(多くの場合、有効)は、心筋症および不整脈を含むいくつかの心毒性効果につながる可能性があります。例えば、従来の(例えば、アントラクリンおよび放射線)および標的化された(例えば、トラスツズマブ)乳癌療法は、患者3のサブセットにおいて心血管合併症を生じ得る。心臓専門医と腫瘍学者の間の緊密な協力(「心臓腫瘍学」の新興分野を介して)は、患者が効果的に治療できることを確実に管理可能にするのに役立ちました2.より明確ではない新しい薬剤の心血管効果であります, Her2とPI3K阻害剤を含む, 特に治療が組み合わせて使用される場合.したがって、ヒト臨床試験の前に、新興の抗癌療法に関連する心血管毒性に対する信頼性の高い前臨床スクリーニング戦略の必要性が高まっています。24時間以上機能的かつ構造的に実行可能なヒト心臓組織の培養システムの利用可能性の欠如は、信頼性の高い心毒性試験の制限要因である。したがって、薬物毒性を試験するための生理学的条件下でヒト心臓組織を培養するための信頼性の高いシステムを開発することが急務である。
最近、人が人工多能性幹細胞由来の心筋細胞(hiPSC-CM)を使用して、この問題に対処するための部分的な解決策を提供した。しかし、hiPSC-CMの未熟な性質と心臓組織の多細胞性と比較した組織完全性の喪失は、この技術4の主要な限界である。最近の研究では、ヒドロゲル上のhiPSC-CMから心臓組織を製造し、時間の経過とともに電気刺激の漸進的な増加を受けることを通じて、この制限を部分的に克服した5。しかし、その電気機械特性は、成人ヒト心筋に見られる成熟を達成しなかった。また、心臓組織は構造的に複雑であり、内皮細胞、ニューロン、および細胞外マトリックスタンパク質の非常に特異的な混合物と共に結合する様々なタイプの間質線維芽細胞を含む様々な細胞タイプから構成されている6。この非心筋細胞の不均一性は、哺乳動物の心臓の成体における非心筋細胞集団の,7、8、9,9が、個々の細胞型を用いて心臓組織をモデル化する上で大きな障害となる。これらの大きな制限は、心臓5の生理学的および病理学的状態を含む最適な研究のために無傷の心臓組織の培養を可能にする方法を開発することの重要性を強調する。
ヒト心臓スライスの培養は、無傷のヒト心筋の有望なモデルである。この技術は、ヒト心筋の生理学的または病理学的状態を確実に反映することができる人間の心臓組織に類似した完全な3D多細胞システムへのアクセスを提供する。しかし、その使用は、2018年10、11、12,11,12まで報告された最も堅牢なプロトコルを使用して24時間を超えない培養における生存率の短い期間によって厳しく制限されている。この制限は、スライスを培養するための空気液体界面の使用、および心臓組織の高エネルギー要求を支持しない単純な培養培地の使用を含む複数の要因によるものであった。我々は最近、連続的な電気刺激を提供し、心臓組織スライスを最大6日間生存可能に保つために培養培地コンポーネントを最適化することができる水没培養システムを開発した。この培養システムは、前臨床と臨床検査の結果の間のギャップを埋めるために、急性心毒性試験のための現場モデルにおいて強力な予測ヒトになる可能性を秘めています。今回の記事では、例として豚の心臓を使用して心臓スライスをスライスし、培養するためのプロトコルを詳述しています。同じプロセスは、人間、犬、羊、または猫の心に適用されます。このプロトコルを使用して、我々は科学界の他の研究所に技術を広めたいと考えています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、急性心毒性13をテストするのに十分な長さの期間の豚の心臓スライスの培養を可能にする簡略化された媒体スループット(最大48スライス/デバイス)の方法のための我々の最近公開された方法のための詳細なビデオプロトコルを説明する。提案された条件は、電気刺激の頻度、栄養素の可用性、および断続的な酸素化を含む心臓の環境を模倣する。私たちは、生物模…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMAMはNIH助成金P30GM127607およびアメリカ心臓協会助成金16SDG29950012によってサポートされています。RB は P01HL78825 および UM1HL113530 でサポートされています。
Materials
| 1000ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks – | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
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