생리적 조건하에서 돼지 하트 를 자르고 배양
Summary
이 프로토콜은 6 일 동안 생리적 조건 하에서 심장 조직을 슬라이스하고 배양하는 방법을 설명합니다. 이 배양 시스템은 3D 심장 모델에서 급성 심장 중독의 신뢰할 수있는 테스트뿐만 아니라 새로운 심부전 치료제의 효능을 테스트하기위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.
Abstract
많은 신규 약물은 현재 시험관내 분석 및 생체 내 동물 모델이 인간의 심장 부채를 제대로 예측하지 못하므로 심장 독성 부작용으로 인한 임상 연구에서 실패하여 제약 산업에 수십억 달러의 부담을 안겨주고 있습니다. 따라서, 비용이 많이 들고 시간 소모 ‘남자에서 처음’ 예심을 착수하기 전에 약 심장 독성을 확인하기 위하여 더 나은 접근을 위한 세계적인 충족되지 않은 의학 필요가 있습니다. 현재, 만 미성숙 심장 세포 (인간 유도 만능 줄기 세포 파생 심근 세포 [hiPSC-CMs])는 장기간 배양 할 수있는 유일한 인간 심장 세포이기 때문에 치료 효율성과 약물 독성을 테스트하는 데 사용됩니다. 약물 효능 및 독성을 테스트하는 데 필요합니다. 그러나, 단일 세포 모형은 다중 세포 모형의 형성되는 복잡한 3D 심혼 조직의 표현형을 복제할 수 없습니다. 중요한 것은, 미성숙 hiPSC-CMs에 비해 다른 특성 과 독성 반응을 가진 성인 심근 세포에 약물의 효력이 시험될 필요가 있습니다. 이 기술은 인간의 심장 조직을 모방하고 인간의 심근의 생리적 또는 병리학적 조건을 반영하는 완전한 다세포 시스템에 대한 액세스를 제공합니다. 최근에는 배양 배지 성분의 최적화와 배양 배지의 연속적인 전기 자극을 포함하는 배양 조건의 최적화와 배양배지의 간헐적 산소화를 통해 생존력을 보존하는 새로운 배양 시스템 설정을 개발했습니다. 그리고 문화에서 6 일 동안 인간과 돼지 심장 조각의 기능. 현재 프로토콜에서는 돼지 심장을 잘라내고 배양하는 방법을 예로 들어 자세히 설명하고 있습니다. 동일한 프로토콜은 인간, 개, 양 또는 고양이 하트에서 조각을 배양하는 데 사용됩니다. 이러한 배양 시스템은 전임상 및 임상 시험 결과 사이의 격차를 좁히는 급성 심독성 검사를 위한 situ 모델에서 강력한 예측 인간이 될 가능성이 있다.
Introduction
약물 유발 심장 독성은 시장 철수의 주요 원인1. 20세기의 마지막 십년간에서, 8개의 비 심장 혈관 약은 심실 부정맥 때문에 급격한 죽음의 결과로 시장에서 철회되었습니다2. 또한, 여러 항암 치료 (많은 경우에 효과적인 동안) 심근 증과 부정맥을 포함 하 여 여러 심장 독성 효과 이어질 수 있습니다. 예를 들어, 전통적인(예를 들어, 안트라시클라인 및 방사선) 및 표적(예를 들어, 트라스투주맙) 유방암 요법은 환자의 서브세트에서 심혈관 합병증을 초래할 수있다 3. 심장 전문의와 종양 전문의 사이의 긴밀한 협력 (“심장 종양학”의 신흥 분야를 통해) 이러한 합병증을 효과적으로 치료 할 수 있도록 관리 할 수 있도록도움이되었습니다 2. Her2 및 PI3K 억제제, 특히 치료가 조합되어 사용될 때 새로운 제제의 심혈관 효과는 명확하지 않습니다. 따라서, 인간 임상 시험 이전에 새로운 항암 치료와 관련된 심혈관 독성에 대한 신뢰할 수 있는 전임상 스크리닝 전략에 대한 필요성이 증가하고 있다. 24시간 이상 기능적으로 그리고 구조적으로 실행 가능한 인간 심장 조직에 대한 배양 시스템의 가용성의 부족은 신뢰할 수 있는 심장 독성 테스트를 위한 제한 요소입니다. 따라서, 약물 독성 시험을 위한 생리적 조건 하에서 인간의 심장 조직을 배양하기 위한 신뢰할 수 있는 시스템을 개발하는 것이 시급하다.
최근 심장 독성 테스트에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CMs)의 사용으로 의한 움직임은 이 문제를 해결하기 위한 부분적인 해결책을 제공하였다; 그러나, hiPSC-CM의 미성숙한 성질과 심장 조직의 다세포 성질에 비해 조직 무결성의 손실은 이 기술의 주요 한계이다4. 최근 연구는 하이드로겔에 hiPSC-CM에서 심장 조직의 제조를 통해 부분적으로 이러한 한계를 극복하고 시간이 지남에 따라 전기 자극의 점진적 증가를 복종5. 그러나, 그들의 전기 기계적 특성은 성인 인간 심근에서 볼 수있는 성숙도를 달성하지 못했습니다. 더욱이, 심장 조직은 구조적으로 더 복잡하며, 내피 세포, 뉴런 및 세포외 기질 성질 섬유아세포의 다양한 유형을 포함하는 다양한 유형의 세포외 매트릭스 단백질의 매우 특이적인 혼합물과 함께 연결되고6. 이러한 비심근세포 세포 집단의 이질성은 성인 포유류 심장에서7,,8,,9가 개별 세포 유형을 이용하여 심장 조직을 모델링하는 데 큰 장애가 된다. 이러한 주요 제한 사항은 심장의 생리적 및 병리학적 조건을 포함하는 최적의 연구를 위해 손상되지 않은 심장 조직의 문화를 가능하게하는 방법 개발의 중요성을강조5.
인간의 심장 조각을 배양하는 것은 그대로 인간의 심근의 유망한 모델입니다. 이 기술은 인간 심근의 생리적 또는 병리학적 조건을 안정적으로 반영할 수 있는 인간의 심장 조직과 유사한 완전한 3D 다세포 시스템에 대한 액세스를 제공합니다. 그러나, 그 사용은 2018년10,,11,,12까지보고된 가장 강력한 프로토콜을 사용하여 24시간 이상 연장되지 않는 배양물의 생존가능성의 짧은 기간에 의해 심각하게 제한되었다. 이러한 제한은 슬라이스를 배양하기 위한 공기-액체 인터페이스의 사용, 및 심장 조직의 높은 에너지 요구를 지원하지 않는 간단한 배양 배지의 사용 등 여러 요인에 기인하였다. 최근 연속적인 전기자극을 제공할 수 있는 침수배양시스템을 개발하고,13일까지심장조직슬라이스를 지속가능한 상태로 유지하기 위해 배양배지 성분을 최적화하였다. 이러한 배양 시스템은 전임상 및 임상 시험 결과 사이의 격차를 해소하기 위해 급성 심독성 시험을 위한 situ 모델에서 강력한 예측 인간이 될 가능성이 있다. 현재 기사에서는 돼지 심장을 예로 사용하여 심장 조각을 자르고 배양하기위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 인간, 개, 양 또는 고양이 의 마음에도 동일한 과정이 적용됩니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 과학 커뮤니티의 다른 실험실에 기술을 전파하기를 희망합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 우리는 급성 심장 독성을 테스트하기에 충분히 긴 기간 동안 돼지 심장 슬라이스의 배양을 가능하게 하는 단순화된 중간 처리량(최대 48개의 슬라이스/장치) 방법에 대한 우리의 최근 발표된 방법에 대한 상세한 비디오 프로토콜을 설명합니다13. 제안된 조건은 전기 자극의 주파수, 영양 가용성 및 간헐적인 산소화를 포함하여 심혼의 환경을 모방합니다. 우리는 우리의 생…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMAM은 NIH 교부금 P30GM127607 및 미국 심장 협회 보조금 16SDG29950012에 의해 지원됩니다. RB는 P01HL78825 및 UM1HL113530에 의해 지원됩니다.
Materials
| 1000ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks – | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
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