Slicing og culturing gris hjerter under fysiologiske forhold
Summary
Denne protokollen beskriver hvordan å skjære og kultur hjertevev under fysiologiske forhold i 6 dager. Dette kultursystemet kan brukes som en plattform for å teste effekten av nye hjertesvikt terapeutiske samt pålitelig testing av akutt kardiotoksisitet i en 3D hjertemodell.
Abstract
Mange nye legemidler mislykkes i kliniske studier på grunn av kardiotoksiske bivirkninger som for tiden tilgjengelig in vitro analyser og in vivo dyremodeller dårlig forutsi menneskelige hjertegjeld, utgjør en multi-milliard-dollar byrde på den farmasøytiske industrien. Derfor er det et verdensomspennende udekket medisinsk behov for bedre tilnærminger for å identifisere narkotika kardiotoksisitet før du foretar kostbart og tidkrevende “første i mennesket” studier. Foreløpig brukes bare umodne hjerteceller (humanindusertpluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter [hiPSC-CMs]) til å teste terapeutisk effektivitet og legemiddeltoksisitet, da de er de eneste menneskelige hjertecellene som kan dyrkes i lengre perioder nødvendig for å teste legemiddeleffekt og toksisitet. En enkelt celletype kan imidlertid ikke replikere fenotypen til det komplekse 3D-hjertevevet som er dannet av flere celletyper. Viktigere, effekten av narkotika må testes på voksne kardiomyocytter, som har forskjellige egenskaper og toksisitetsresponser sammenlignet med umodne hiPSC-CMs. Culturing menneskelige hjerteskiver er en lovende modell av intakt menneskelig myokardiet. Denne teknologien gir tilgang til et komplett flercellet system som etterligner det menneskelige hjertevevet og gjenspeiler de fysiologiske eller patologiske forholdene i det menneskelige myokardiet. Nylig, gjennom optimalisering av kulturmediekomponenter og kulturforholdene for å inkludere kontinuerlig elektrisk stimulering på 1,2 Hz og intermitterende oksygenering av kulturmediet, utviklet vi et nytt kultursystemoppsett som bevarer levedyktighet og funksjonaliteten til menneske- og grisehjerteskiver i 6 dager i kulturen. I den nåværende protokollen beskriver vi metoden for kutting og kuling av grisehjerte som et eksempel. Den samme protokollen brukes til å dyrke skiver fra menneske, hund, sauer eller kattehjerter. Dette kultursystemet har potensial til å bli et kraftig prediktivt menneske in situ-modell for akutt kardiotoksisitetstesting som lukker gapet mellom prekliniske og kliniske testresultater.
Introduction
Legemiddelindusert kardiotoksisitet er en viktig årsak til markedsuttak1. I det siste tiåret av20-tallet ble åtte ikke-kardiovaskulære legemidler trukket tilbake fra markedet da de resulterte i plutselig død på grunn av ventrikulære arytmier2. I tillegg kan flere anti-kreft behandlinger (mens i mange tilfeller effektiv) føre til flere kardiotoksiske effekter inkludert kardiomyopati og arytmier. For eksempel kan både tradisjonelle (f.eks. antracykliner og stråling) og målrettet (f.eks trastuzumab) brystkreftbehandling føre til kardiovaskulære komplikasjoner hos en undergruppe av pasienter3. Et nært samarbeid mellom kardiologer og onkologer (via det nye feltet av “kardio-onkologi”) har bidratt til å gjøre disse komplikasjonene håndterbare for å sikre at pasientene kan behandles effektivt2. Mindre klare er kardiovaskulære effekter av nyere midler, inkludert Her2 og PI3K hemmere, spesielt når terapi brukes i kombinasjon. Derfor er det et økende behov for pålitelige prekliniske screeningstrategier for kardiovaskulærtoksisitet forbundet med nye anti-kreftbehandlinger før kliniske studier hos mennesker. Mangelen på tilgjengelighet av kultursystemer for menneskelig hjertevev som er funksjonelt og strukturelt levedyktig for mer enn 24 timer er en begrensende faktor for pålitelig kardiotoksisitetstesting. Derfor er det et presserende behov for å utvikle et pålitelig system for å kule menneskelig hjertevev under fysiologiske forhold for testing av legemiddeltoksisitet.
Den siste overgangen mot bruk av humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) i kardiotoksisitetstesting har gitt en delvis løsning for å løse dette problemet; Imidlertid er den umodne naturen til hiPSC-CMs og tap av vevsintegritet sammenlignet med flercellet natur hjertevevet store begrensninger i denne teknologien4. En fersk studie har delvis overvunnet denne begrensningen gjennom fabrikasjon av hjertevev fra hiPSC-CMs på hydrogeler og utsette dem for gradvis økning i elektrisk stimulering over tid5. Imidlertid oppnådde deres elektromekaniske egenskaper ikke modenhet sett i det voksne menneskelige myokardiet. Videre er hjertevevet strukturelt mer komplisert, som består av ulike celletyper, inkludert endotelceller, nevroner og ulike typer stromal fibroblaster knyttet sammen med en svært spesifikk blanding av ekstracellulære matriseproteiner6. Denne heterogeniteten til den ikke-kardiomycytcellepopulasjonen7,8,9 i voksen pattedyrhjerte er et stort hinder for modellering av hjertevev ved hjelp av individuelle celletyper. Disse store begrensningene understreker viktigheten av å utvikle metoder for å muliggjøre kultur av intakt hjertevev for optimale studier som involverer fysiologiske og patologiske forhold i hjertet5.
Culturing menneskelige hjerte skiver er en lovende modell av intakt menneskelig myokardiet. Denne teknologien gir tilgang til et komplett 3D flercellet system som ligner på det menneskelige hjertevevet som på en pålitelig måte kan gjenspeile de fysiologiske eller patologiske forholdene i det menneskelige myokardiet. Bruken har imidlertid vært sterkt begrenset av den korte perioden med levedyktighet i kultur, som ikke strekker seg utover 24 timer ved hjelp av de mest robuste protokollene rapportert før 201810,11,12. Denne begrensningen skyldtes flere faktorer, inkludert bruk av luftflytende grensesnitt for å dyrke skivene, og bruk av et enkelt kulturmedium som ikke støtter hjertevevets høye energiske krav. Vi har nylig utviklet et nedsenket kultursystem som er i stand til å gi kontinuerlig elektrisk stimulering og optimalisert kulturmediekomponentene for å holde hjertevevskiver levedyktigi opptil 6 dager13. Dette kultursystemet har potensial til å bli et kraftig prediktivt menneske in situ-modell for akutt kardiotoksisitetstesting for å lukke gapet mellom prekliniske og kliniske testresultater. I den nåværende artikkelen beskriver vi protokollen for kutting og kuling av hjerteskiver ved hjelp av et grisehjerte som et eksempel. Den samme prosessen brukes på menneske,hund, sau eller kattehjerter. Med denne protokollen håper vi å spre teknologien til andre laboratorier i det vitenskapelige samfunnet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi den detaljerte videoprotokollen for vår nylig publiserte metode for forenklet medium gjennomstrømning (prosesser opp til 48 skiver / enhet) metode som muliggjør kultur av gris hjerteskiver for en periode tilstrekkelig lang til å teste akutt kardiotoksisitet13. De foreslåtte forholdene etterligner hjertets miljø, inkludert hyppigheten av elektrisk stimulering, næringstilgjengelighet og intermitterende oksygenering. Vi tilskriver den langvarige levedyktigheten til hjerteskive…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMAM støttes av NIH-stipendet P30GM127607 og American Heart Association stipend 16SDG29950012. RB støttes av P01HL78825 og UM1HL113530.
Materials
| 1000ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks – | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
- Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10 (2016).
- Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
- Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
- Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
- Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).
- Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).
- Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).
