Fatiamento e cultivo de corações de porco condições fisiológicas
Summary
Este protocolo descreve como cortar e cultivar tecido cardíaco condições fisiológicas por 6 dias. Este sistema de cultura poderia ser usado como uma plataforma para testar a eficácia de novas terapêuticas de insuficiência cardíaca, bem como testes confiáveis de cardiotoxicidade aguda em um modelo de coração 3D.
Abstract
Muitas drogas novas falham em estudos clínicos devido a efeitos colaterais cardiotóxicos como os ensaios in vitro disponíveis atualmente e modelos animais in vivo mal prevêem passivos cardíacos humanos, representando um fardo multibilionário para a indústria farmacêutica. Portanto, há uma necessidade médica não atendida mundial de melhores abordagens para identificar a cardiotoxicidade medicamentosa antes de realizar testes caros e demorados “primeiro no homem”. Atualmente, apenas células cardíacas imaturas (cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco induzidas por humanos [hiPSC-CMs]) são usados para testar a eficiência terapêutica e a toxicidade das drogas, pois são as únicas células cardíacas humanas que podem ser cultivadas por períodos prolongados necessário para testar a eficácia e toxicidade da droga. No entanto, um único tipo de célula não pode replicar o fenótipo do complexo tecido cardíaco 3D que é formado por múltiplos tipos de células. É importante ressaltar que o efeito das drogas precisa ser testado em cardiomiócitos adultos, que têm características diferentes e respostas de toxicidade em comparação com os imaturos hiPSC-CMs. A combinação de fatias de coração humano é um modelo promissor de miocárdio humano intacto. Esta tecnologia fornece acesso a um sistema multicelular completo que imita o tecido cardíaco humano e reflete as condições fisiológicas ou patológicas do miocárdio humano. Recentemente, através da otimização dos componentes da mídia cultural e das condições de cultura para incluir estimulação elétrica contínua a 1,2 Hz e oxigenação intermitente do meio de cultura, desenvolvemos uma nova configuração do sistema de cultura que preserva a viabilidade e funcionalidade de fatias de coração humano e porco por 6 dias na cultura. No protocolo atual, estamos detalhando o método para cortar e cultivar coração de porco como exemplo. O mesmo protocolo é usado para cultivar fatias de corações humanos, cães, ovelhas ou gatos. Este sistema de cultura tem o potencial de se tornar um poderoso modelo preditivo humano in situ para testes de cardiotoxicidade aguda que fecha a lacuna entre os resultados de testes pré-clínicos e clínicos.
Introduction
A cardiotoxicidade induzida por drogas é uma das principais causas de retirada do mercado1. Na última década doséculo XX, oito drogas não cardiovasculares foram retiradas do mercado, pois resultaram em morte súbita por arritmias ventriculares2. Além disso, várias terapias anticancerígenas (embora em muitos casos eficazes) podem levar a vários efeitos cardiotóxicos, incluindo cardiomiopatia e arritmias. Por exemplo, tanto as terapias tradicionais (por exemplo, antrasicopas e radiação) quanto as terapias direcionadas (por exemplo, trastuzumabe) podem resultar em complicações cardiovasculares em um subconjunto de pacientes3. Uma estreita colaboração entre cardiologistas e oncologistas (através do campo emergente da “cardio-oncologia”) ajudou a tornar essas complicações gerenciáveis garantindo que os pacientes possam ser tratados efetivamente2. Menos claros são os efeitos cardiovasculares de agentes mais novos, incluindo inibidores Her2 e PI3K, especialmente quando as terapias são usadas em combinação. Portanto, há uma necessidade crescente de estratégias de triagem pré-clínica confiáveis para toxicidades cardiovasculares associadas a terapias anticancerígenas emergentes antes de ensaios clínicos em humanos. A falta de disponibilidade de sistemas de cultura para tecido cardíaco humano que seja funcional e estruturalmente viável por mais de 24 h é um fator limitante para testes de cardiotoxicidade confiáveis. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver um sistema confiável para a cultura do tecido cardíaco humano condições fisionicais para testar a toxicidade das drogas.
O recente movimento em direção ao uso de cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco induzidas por humanos (hiPSC-CMs) em testes de cardiotoxicidade forneceu uma solução parcial para resolver essa questão; no entanto, a natureza imatura dos hiPSC-CMs e a perda de integridade tecidual em comparação com a natureza multicelular do tecido cardíaco são grandes limitações desta tecnologia4. Um estudo recente superou parcialmente essa limitação através da fabricação de tecidos cardíacos de hiPSC-CMs em hidrogéis e submetendo-os ao aumento gradual da estimulação elétrica ao longo do tempo5. No entanto, suas propriedades eletromecânicas não atingiram a maturidade observada no miocárdio humano adulto. Além disso, o tecido cardíaco é estruturalmente mais complicado, sendo composto de vários tipos de células, incluindo células endoteliais, neurônios e vários tipos de fibroblastos estrônticos ligados a uma mistura muito específica de proteínas matrizes extracelulares6. Essa heterogeneidade da população de células não cardiomiócitos7,8,9 no coração de mamíferos adultos é um grande obstáculo na modelagem do tecido cardíaco usando tipos de células individuais. Essas principais limitações destacam a importância do desenvolvimento de métodos para permitir a cultura de tecido cardíaco intacto para estudos ideais envolvendo condições fisiológicas e patológicas do coração5.
Cultivar fatias de coração humano é um modelo promissor de miocárdio humano intacto. Esta tecnologia fornece acesso a um sistema multicelular 3D completo que é semelhante ao tecido cardíaco humano que poderia refletir de forma confiável as condições fisiológicas ou patológicas do miocárdio humano. No entanto, seu uso tem sido severamente limitado pelo curto período de viabilidade na cultura, que não se estende além de 24 h utilizando os protocolos mais robustos relatados até 201810,11,12. Essa limitação deveu-se a múltiplos fatores, incluindo o uso da interface ar-líquido para cultivar as fatias, e o uso de um meio de cultura simples que não suporta as altas demandas energéticas do tecido cardíaco. Recentemente desenvolvemos um sistema de cultura submerso que é capaz de fornecer estimulação elétrica contínua e otimizar os componentes da mídia cultural para manter as fatias de tecido cardíaco viáveis por até 6 dias13. Este sistema de cultura tem o potencial de se tornar um poderoso modelo preditivo humano in situ para testes de cardiotoxicidade aguda para fechar a lacuna entre os resultados de testes pré-clínicos e clínicos. No artigo atual, estamos detalhando o protocolo para cortar e cultivar as fatias do coração usando como exemplo um coração de porco. O mesmo processo é aplicado a corações humanos, cães, ovelhas ou gatos. Com este protocolo, esperamos espalhar a tecnologia para outros laboratórios da comunidade científica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos o protocolo de vídeo detalhado para o nosso método recém-publicado para o método de throughput médio simplificado (processos de até 48 fatias/dispositivo) que permite a cultura de fatias de coração de porco por um período suficientemente longo para testar cardiotoxicidade aguda13. As condições propostas imitam o ambiente do coração, incluindo frequência de estimulação elétrica, disponibilidade de nutrientes e oxigenação intermitente. Atribuímos a viabilidade pr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O TMAM é apoiado pelo subsídio NIH P30GM127607 e pela American Heart Association 16SDG29950012. RB é suportado por P01HL78825 e UM1HL113530.
Materials
| 1000ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks – | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
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