Skivning och odling Gris hjärtan under fysiologiska förhållanden
Summary
Detta protokoll beskriver hur man skär och kultur hjärtvävnad under fysiologiska förhållanden i 6 dagar. Detta kultursystem skulle kunna användas som en plattform för att testa effekten av nya hjärtsvikt therapeutics samt tillförlitlig testning av akut kardiotoxicitet i en 3D-hjärtmodell.
Abstract
Många nya läkemedel misslyckas i kliniska studier på grund av kardiotoxiska biverkningar som den för närvarande tillgängliga in vitro-analyser och in vivo djurmodeller dåligt förutsäga mänskliga hjärtåtaganden, utgör en flera miljarder dollar börda på läkemedelsindustrin. Därför finns det ett världsomspännande otillfredsställt medicinskt behov av bättre metoder för att identifiera narkotika kardiotoxicitet innan företaget kostsamma och tidskrävande “första i människan” prövningar. För närvarande används endast omogna hjärtceller (humaninducerad pluripotenta stamceller kardiomyocyter [hiPSC-CMs]) för att testa terapeutisk effektivitet och läkemedelstoxicitet eftersom de är de enda mänskliga hjärtceller som kan odlas under längre perioder läkemedelseffekt och toxicitet. En enda celltyp kan dock inte replikera fenotypen av den komplexa 3D-hjärtvävnaden som bildas av flera celltyper. Viktigt, effekten av läkemedel måste testas på vuxna kardiomyocyter, som har olika egenskaper och toxicitet svar jämfört med omogna hiPSC-CMs. Culturing mänskliga hjärtat skivor är en lovande modell av intakt mänskliga hjärtmuskeln. Denna teknik ger tillgång till ett komplett flercelligt system som efterliknar den mänskliga hjärtvävnaden och återspeglar de fysiologiska eller patologiska förhållandena i det mänskliga hjärtmuskeln. Nyligen, genom optimering av kulturmediekomponenter och kulturförhållanden för att inkludera kontinuerlig elektrisk stimulering vid 1,2 Hz och intermittent syresättning av odlingsmediet, utvecklade vi en ny kultur system setup som bevarar lönsamheten och funktionalitet av mänskliga och gris hjärta skivor för 6 dagar i kultur. I det nuvarande protokollet beskriver vi metoden för skivning och odling av grishjärta som ett exempel. Samma protokoll används för att odla skivor från människor, hund, får eller katt hjärtan. Detta kultursystem har potential att bli en kraftfull prediktiv människa in situ-modell för akut kardiotoxicitet testning som stänger klyftan mellan prekliniska och kliniska testresultat.
Introduction
Läkemedelsinducerad kardiotoxicitet är en viktig orsak till återtag på marknaden1. Under det sista årtiondet av20-talet, åtta icke-kardiovaskulära läkemedel drogs tillbaka från marknaden eftersom de resulterade i plötslig död på grund av ventrikulära arytmier2. Dessutom, flera anti-cancer terapier (medan i många fall effektiva) kan leda till flera kardiotoxiska effekter inklusive kardiomyopati och arytmier. Till exempel kan både traditionella (t.ex. antracykliner och strålning) och riktade (t.ex. trastuzumab) bröstcancerbehandlingar resultera i kardiovaskulära komplikationer hos en delmängd av patienter3. Ett nära samarbete mellan kardiologer och onkologer (via det framväxande området “kardio-onkologi”) har bidragit till att göra dessa komplikationer hanterbara att säkerställa att patienter kan behandlas effektivt2. Mindre tydliga är de kardiovaskulära effekterna av nyare medel, inklusive Her2- och PI3K-hämmare, särskilt när terapier används i kombination. Därför finns det ett växande behov av tillförlitliga prekliniska screening strategier för kardiovaskulär toxicitet i samband med nya anti-cancer terapier före kliniska prövningar på människa. Bristen på tillgång till kultursystem för mänskliga hjärtvävnad som är funktionellt och strukturellt livskraftig för mer än 24 h är en begränsande faktor för tillförlitlig konditionsränxicitet testning. Därför finns det ett akut behov av att utveckla ett tillförlitligt system för odling av mänsklig hjärtvävnad under fysiologiska förhållanden för att testa läkemedelstoxicitet.
Den senaste tidens steg mot användning av humaninducerade pluripotenta stamceller kardiomyocyter (hiPSC-CMs) i kardiotoxicitet testning har gett en partiell lösning för att ta itu med detta problem; Dock är den omogna karaktären hos hiPSC-CMs och förlusten av vävnadsintegritet jämfört med den flercelliga karaktären hos hjärtvävnaden stora begränsningar av denna teknik4. En nyligen genomförd studie har delvis övervinna denna begränsning genom tillverkning av hjärtvävnader från hiPSC-CMs på hydrogeler och utsätta dem för gradvis ökning av elektrisk stimulering över tiden5. Deras elektromekaniska egenskaper uppnådde dock inte mognaden som sågs i det vuxna mänskliga hjärtmuskeln. Dessutom är hjärtvävnaden strukturellt mer komplicerad, som består av olika celltyper inklusive endotelceller, nervceller och olika typer av stromala fibroblaster kopplade tillsammans med en mycket specifik blandning av extracellulära matrisproteiner6. Denna heterogenitet av icke-kardiomyocytecellpopulationen 7,8,9 i den vuxna däggdjur hjärta är ett stort hinder i modellering hjärtvävnad med hjälp av enskilda celltyper. Dessa stora begränsningar belyser vikten av att utveckla metoder för att möjliggöra odling av intakt hjärtvävnad för optimala studier med fysiologiska och patologiska tillstånd i hjärtat5.
Odling av mänskliga hjärtskivor är en lovande modell av intakt mänskligt hjärtmuskeln. Denna teknik ger tillgång till ett komplett 3D flercellssystem som liknar den mänskliga hjärtvävnaden som på ett tillförlitligt sätt kan återspegla de fysiologiska eller patologiska förhållandena i det mänskliga hjärtmuskeln. Dess användning har dock varit kraftigt begränsad av den korta perioden av livskraft i kulturen, som inte sträcker sig längre än 24 timmar med hjälp av de mest robusta protokoll som rapporterats fram till 201810,11,12. Denna begränsning berodde på flera faktorer, inklusive användning av luft-flytande gränssnitt för att odla skivorna, och användningen av en enkel odling medium som inte stöder de höga energiska kraven i hjärtvävnaden. Vi har nyligen utvecklat ett nedsänkt kultursystem som kan ge kontinuerlig elektrisk stimulering och optimerat komponenterna kulturmedia för att hålla hjärtvävnadsskivorna livskraftiga i upp till 6 dagar13. Detta kultursystem har potential att bli en kraftfull prediktiv människa in situ-modell för akut kardiotoxicitet testning för att minska klyftan mellan prekliniska och kliniska testresultat. I den aktuella artikeln beskriver vi protokollet för skivning och odling av hjärtat skivor med hjälp av en gris hjärta som ett exempel. Samma process tillämpas på människor, hund, får eller katt hjärtan. Med detta protokoll hoppas vi kunna sprida tekniken till andra laboratorier i forskarvärlden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi detaljerade videoprotokoll för vår nyligen publicerade metod för förenklad medium genomströmning (processer upp till 48 skivor / enhet) metod som möjliggör kultur av svin hjärta skivor under en period tillräckligt lång för att testa akut kardiotoxicitet13. De föreslagna förhållandena efterliknar miljön i hjärtat, inklusive frekvensen av elektrisk stimulering, näringstillgänglighet, och intermittent syresättning. Vi tillskriver den långvariga livskraften hos hj…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMAM stöds av NIH-bidraget P30GM127607 och American Heart Association grant 16SDG29950012. RB stöds av P01HL78825 och UM1HL113530.
Materials
| 1000ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks – | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
- Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10 (2016).
- Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
- Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
- Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
- Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).
- Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).
- Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).
