Dans le protocole actuel, nous expliquons comment traiter et culturer facilement les cellules monnucléaires amygdaler des humains sains subissant l’amygdalectomie chirurgicale partielle pour étudier les réponses immunitaires innées lors de l’activation, imitant l’infection virale dans les tissus muqueuses.
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Article de méthode
Isolement des cellules monnucléaires tonsillar pour étudier les réponses immunitaires innées Ex Vivo dans un tissu lymphoïde muqueuse humain
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’étude des cellules isolées des tissus lymphoïdes associés à la muqueuse (MALT) permet de comprendre la réponse des cellules immunitaires dans les pathologies impliquant l’immunité muqueuse, car elles peuvent modéliser les interactions hôte-pathogène dans le tissu. Alors que les cellules isolées dérivées des tissus étaient le premier modèle de culture cellulaire, leur utilisation a été négligée parce que les tissus peuvent être difficiles à obtenir. Dans le présent protocole, nous expliquons comment traiter et culturer facilement les cellules monnucléaires amygdales (TMCs) à partir d’amygdales humaines saines pour étudier les réponses immunitaires innées lors de l’activation, imitant l’infection virale dans les tissus muqueuses. L’isolement des TMCs des amygdales est rapide, parce que les amygdales ont à peine de l’épithélium et de produire jusqu’à des milliards de tous les principaux types de cellules immunitaires. Cette méthode permet la détection de la production de cytokines à l’aide de plusieurs techniques, y compris les immunotests, qPCR, microscopie, cytométrie de flux, etc., semblables à l’utilisation de cellules mononucléaires périphériques (PBMC) à partir du sang. De plus, les CTM présentent une plus grande sensibilité aux tests de dépistage des drogues que les PBMC, qui doivent être prises en considération pour les futurs tests de toxicité. Ainsi, les cultures ex vivo TMCs sont un modèle muqueuse facile et accessible.
Introduction
Les études sur les organes humains sont limitées en raison de l’accessibilité ainsi que des raisons éthiques évidentes. Cependant, ils sont essentiels pour bien comprendre la complexité de la biologie humaine. Les cultures de cellules isolées (cultures primaires ou lignées cellulaires) sont un système standard dans les études de biologie cellulaire en raison de leur disponibilité. Bien que les cultures cellulaires isolées aient permis des découvertes exceptionnelles, l’utilisation de lignées cellulaires a fait l’objet d’un examen plus approfondi parce qu’elles n’imitent pas entièrement la biologie in vivo des organes. Cependant, la culture des cellules tridimensionnel....
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Protocole
Les spécimens ne sont pas recueillis spécifiquement à des fins de recherche et l’étude n’est pas considérée comme envahissante. Toutefois, la collecte des amygdales humaines nécessite l’approbation éthique des autorités locales compétentes. Dans notre cas, il a été approuvé par le Comité de protection des personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). De plus, le consentement de chaque patient ou représentant légal est demandé pour obtenir les données personnelles des donneurs (p. ex., sexe, âge, antécédents d’infections ORL) qui peuvent aider à interpréter les résultats expérimentaux.
1. Manipulation du tissu amygdaler humain
- Placez le....
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Résultats
Nous avons d’abord caractérisé le profil immunitaire des cellules présentes dans la culture et analysé la quantité de TMCs. Nous avons phénypique les TMC des amygdales avec la cytométrie de flux. Comme le montre la figure 1, tous les principaux types de cellules immunitaires présents dans les PBMC provenant du sang étaient représentés dans les TMC à partir d’amygdales. Toutefois, dans les TMC, la fréquence de tous les types de cellules, à l’exception des cell.......
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Discussion
Les amygdales humaines représentent un modèle ex vivo intégratif et physiologique pour étudier les réponses immunitaires innées à l’interface muqueuse, parce qu’elles imitent le rôle d’un organe lymphoïde secondaire. Fait intéressant, la composition cellulaire des TMC est similaire aux PBMC et comprend toutes les principales populations de cellules, bien que leur pourcentage puisse être différent des PBMC du sang (figure 1). D’autres populations peuvent également être trouvées, car toutes le.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par l’Agence nationale de la recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) pour les expériences et la bourse du N.-B. (AAP 2017 166). N.S. reconnaît le soutien de l’ANRS pour la bourse (AAP 2016 1), de l’Organisation européenne de biologie moléculaire EMBO for Fellowship (LT 834 2017), du programme de financement de démarrage « Baustein » de la Faculté de médecine de l’Université d’Ulm (LSBN.0147) et de la Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Grille en acier 10 mailles - 1910 & micro ; m | Dutscher | 198586 | Pour mettre dans la crépine à cellules Cellector |
| 60 mailles grille en acier - 230 µ ; m | Dutscher | 198591 | Pour mettre dans la crépine cellulaire Cellector |
| 70 µ ; m white ClearLine filtres à cellules | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D détergent | Dutscher | 59852 | Détergent |
| Solution antibiotique, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium et 100 &mu ; g/mL Streptomycine - à ajouter au milieu de culture |
| BD FalconTM Tubes à fond rond, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACIS Tubes |
| Cellector, 85 mL et 37 mm de diamètre | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Essai de viabilité cellulaire luminescente | Promega | G7572 | Centrifugeuse |
| 5810 R | Eppendorf | ||
| Tubes coniques Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Pince à épiler incurvée | Dutscher | 711200 | |
| Diméthyl sulfoxyde (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Sans calcium ni magnésium |
| EnVision | PerkinElmer | Mesure la luminescence | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | À ajouter au milieu de culture | ||
| Marqueurs de fluorescence anticorps | Voir le tableau 1 | ||
| Pilon en verre | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | Utilisation à 20 mM |
| Incubateur | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Dosage immunologique à base de billes |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Milieu de gradient de densité |
| Conteneur Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | Récipient de congélation lente |
| Pierce 16 % Formaldéhyde (p/v), sans méthanol | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agoniste |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Boîte de culture cellulaire, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Lame chirurgicale stérile N° ; 23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Perles de compensation | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Thermo Fisher | 15575020 | Pour faire du tampon de lavage en PBS |
Références
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O.
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Réimpressions et autorisations
