Isolement des cellules monnucléaires tonsillar pour étudier les réponses immunitaires innées Ex Vivo dans un tissu lymphoïde muqueuse humain

Summary

Dans le protocole actuel, nous expliquons comment traiter et culturer facilement les cellules monnucléaires amygdaler des humains sains subissant l’amygdalectomie chirurgicale partielle pour étudier les réponses immunitaires innées lors de l’activation, imitant l’infection virale dans les tissus muqueuses.

Abstract

L’étude des cellules isolées des tissus lymphoïdes associés à la muqueuse (MALT) permet de comprendre la réponse des cellules immunitaires dans les pathologies impliquant l’immunité muqueuse, car elles peuvent modéliser les interactions hôte-pathogène dans le tissu. Alors que les cellules isolées dérivées des tissus étaient le premier modèle de culture cellulaire, leur utilisation a été négligée parce que les tissus peuvent être difficiles à obtenir. Dans le présent protocole, nous expliquons comment traiter et culturer facilement les cellules monnucléaires amygdales (TMCs) à partir d’amygdales humaines saines pour étudier les réponses immunitaires innées lors de l’activation, imitant l’infection virale dans les tissus muqueuses. L’isolement des TMCs des amygdales est rapide, parce que les amygdales ont à peine de l’épithélium et de produire jusqu’à des milliards de tous les principaux types de cellules immunitaires. Cette méthode permet la détection de la production de cytokines à l’aide de plusieurs techniques, y compris les immunotests, qPCR, microscopie, cytométrie de flux, etc., semblables à l’utilisation de cellules mononucléaires périphériques (PBMC) à partir du sang. De plus, les CTM présentent une plus grande sensibilité aux tests de dépistage des drogues que les PBMC, qui doivent être prises en considération pour les futurs tests de toxicité. Ainsi, les cultures ex vivo TMCs sont un modèle muqueuse facile et accessible.

Introduction

Les études sur les organes humains sont limitées en raison de l’accessibilité ainsi que des raisons éthiques évidentes. Cependant, ils sont essentiels pour bien comprendre la complexité de la biologie humaine. Les cultures de cellules isolées (cultures primaires ou lignées cellulaires) sont un système standard dans les études de biologie cellulaire en raison de leur disponibilité. Bien que les cultures cellulaires isolées aient permis des découvertes exceptionnelles, l’utilisation de lignées cellulaires a fait l’objet d’un examen plus approfondi parce qu’elles n’imitent pas entièrement la biologie in vivo des organes. Cependant, la culture des cellules tridimensionnel....

Protocol

Les spécimens ne sont pas recueillis spécifiquement à des fins de recherche et l’étude n’est pas considérée comme envahissante. Toutefois, la collecte des amygdales humaines nécessite l’approbation éthique des autorités locales compétentes. Dans notre cas, il a été approuvé par le Comité de protection des personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). De plus, le consentement de chaque patient ou représentant légal est demandé pour obtenir les données personnelles des donneurs (p. ex., sexe, âge, antécédents d’infections ORL) qui peuvent aider à interpréter les résultats expérimentaux.

1. Manipulation du tissu amygdaler humain

1. Placez le....

Results

Nous avons d’abord caractérisé le profil immunitaire des cellules présentes dans la culture et analysé la quantité de TMCs. Nous avons phénypique les TMC des amygdales avec la cytométrie de flux. Comme le montre la figure 1, tous les principaux types de cellules immunitaires présents dans les PBMC provenant du sang étaient représentés dans les TMC à partir d’amygdales. Toutefois, dans les TMC, la fréquence de tous les types de cellules, à l’exception des cell.......

Discussion

Les amygdales humaines représentent un modèle ex vivo intégratif et physiologique pour étudier les réponses immunitaires innées à l’interface muqueuse, parce qu’elles imitent le rôle d’un organe lymphoïde secondaire. Fait intéressant, la composition cellulaire des TMC est similaire aux PBMC et comprend toutes les principales populations de cellules, bien que leur pourcentage puisse être différent des PBMC du sang (figure 1). D’autres populations peuvent également être trouvées, car toutes le.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grille en acier 10 mailles - 1910 & micro ; m	Dutscher	198586	Pour mettre dans la crépine à cellules Cellector
60 mailles grille en acier - 230 µ ; m	Dutscher	198591	Pour mettre dans la crépine cellulaire Cellector
70 µ ; m white ClearLine filtres à cellules	Dutscher	141379C
Anios Excell D détergent	Dutscher	59852	Détergent
Solution antibiotique, 100x	Thermo Fisher	15140122	100 U/mL Penicilium et 100 &mu ; g/mL Streptomycine - à ajouter au milieu de culture
BD FalconTM Tubes à fond rond, 5 mL	BD Biosciences	352063	FACIS Tubes
Cellector, 85 mL et 37 mm de diamètre	Dutscher	198585
CellTiter-Glo (CTG) Essai de viabilité cellulaire luminescente	Promega	G7572	Centrifugeuse
5810 R	Eppendorf
Tubes coniques Falcon 50 mL	Dutscher	352070
Pince à épiler incurvée	Dutscher	711200
Diméthyl sulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Sans calcium ni magnésium
EnVision	PerkinElmer		Mesure la luminescence
Sérum fœtal bovin (FBS)			À ajouter au milieu de culture
Marqueurs de fluorescence anticorps	Voir le tableau 1
Pilon en verre	Dutscher	198599
Hepes (1 M)	Thermo Fisher	15630056	Utilisation à 20 mM
Incubateur
LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel	BioLegend	740390	Dosage immunologique à base de billes
Lymphoprep	StemCell	7801	Milieu de gradient de densité
Conteneur Mr. Frosty	Thermo Fisher	5100-0001	Récipient de congélation lente
Pierce 16 % Formaldéhyde (p/v), sans méthanol	Thermo Fisher	28908
Resiquimod (R848)	InvivoGen	tlrl-r848	TLR7/8 agoniste
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich	R8758
SPL Boîte de culture cellulaire, 150 mm x 25 mm (SPL150)	Dutscher	330009
Lame chirurgicale stérile N° ; 23	Dutscher	132523
UltraComp eBeads Perles de compensation	Thermo Fisher	01-2222-41
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Thermo Fisher	15575020	Pour faire du tampon de lavage en PBS