Tradurre la purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per studiare lo sviluppo della radice di Arabidopsis thaliana su una scala specifica del tipo di cella

Summary

Tradurre la purificazione dell’affinità di ribosomi (TRAP) offre la possibilità di sezionare programmi di sviluppo con una minima elaborazione di organi e tessuti. Il protocollo produce RNA di alta qualità da cellule mirate con una sottounità ribosomica denominata GFP (Proteina fluorescente verde). Gli strumenti di analisi a valle, come qRT-PCR o RNA-seq, rivelano profili di espressione specifici del tessuto e del tipo di cellula.

Abstract

In questo articolo, diamo istruzioni pratiche per ottenere dati translatomi da diversi tipi di cellule della radice di Arabidopsis thaliana tramite il metodo di purificazione dell’affinità del ribosoma di traduzione (TRAP) e la preparazione consecutiva della libreria a basso input.

Come materiale di partenza, impieghiamo linee vegetali che esprimono RPL18 di proteine ribosomiche marcate tramite GFP in modo specifico del tipo di cellula mediante l’uso di promotori adeguati. Prima dell’immunopurificazione e dell’estrazione dell’RNA, il tessuto viene congelato allo snap, che conserva l’integrità dei tessuti e contemporaneamente consente l’esecuzione di studi di serie temporali ad alta risoluzione temporale. In particolare, le strutture delle pareti cellulari rimangono intatte, il che è uno dei principali inconvenienti nelle procedure alternative come gli approcci basati sullo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza che si basano sulla protonodurata dei tessuti per isolare popolazioni cellulari distinte. Inoltre, non è necessaria alcuna fissazione dei tessuti come nelle tecniche basate sulla microdissezione di cattura laser, che consente di ottenere RNA di alta qualità.

Tuttavia, il campionamento dalle sottopopolazioni di cellule e solo l’isolamento dell’RNA associato al polisomo limita gravemente la resa dell’RNA. È quindi necessario applicare metodi di preparazione della libreria sufficientemente sensibili per una corretta acquisizione dei dati da parte dell’RNA-seq.

TRAP offre uno strumento ideale per la ricerca sulle piante, poiché molti processi di sviluppo coinvolgono percorsi di segnalazione meccanica e correlati alle pareti cellulari. L’uso di promotori per colpire specifiche popolazioni di cellule sta colmando il divario tra il livello di organo e a livello di singola cellula che a sua volta soffrono di poca risoluzione o di costi molto elevati. Qui, applichiamo il TRAP per studiare la comunicazione cellulare nella formazione laterale della radice.

Introduction

Spinto dalla crescente applicazione delle tecniche di sequenziamento di prossima generazione, la risoluzione spaziale nella biologia dello sviluppo potrebbe essere aumentata. Studi contemporanei mirano a sezionare i tessuti verso il basso per tipi di cellule specializzate, se non il livello a cella singola^1,2,3^,4.⁴ A tal fine, negli ultimi cinquant’anni è stata ideata una pletora di metodi diversi (vedi Figura 1A)^{5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}.

Molti strumenti nella scienza delle piante sono stati adattamenti di tecniche che sono state introdotte nella ricerca animale. Questo non è il caso per il metodo che stiamo introducendo in dettaglio qui. Nel 2005, dotato di un forte background nella traduzione delle proteine, il Bailey-Serres Lab ha deciso di progettare proteine ribosomiche per la successiva purificazione dell’affinità¹⁶. Così, potrebbero evitare la profilazione polisografica lunga e laboriosa, che si basa sull’ultracentrifugazione con un gradiente di saccarosio ed è stato utilizzato per valutare i ribosomi traslitteranti dal 1960^17,18. Da allora il metodo è stato indicato come trap (Affinity purificazione)¹⁶. Dopo studi translatomi di successo in piante, Heiman et al. adattato TRAP per gli animali¹⁹ e altri esteso la sua applicazione al lievito²⁰, Drosophila²¹, Xenopus²² e pesce zebra^23,24.

Anche se la modificazione genetica del sistema modello è un prerequisito per il TRAP, che limita la sua applicazione alle specie suscettibili di trasformazione genetica, si può allo stesso tempo sfruttare questa obiezione per indirizzare sottoinsiemi di cellule che sono di particolare interesse e altrimenti estremamente difficili da isolare dal tessuto intatto / organo²⁵ (ad esempio, cellule dendritiche altamente ramificate in un cervello di topo o iphae fungini intessuto vegetale infetto). Nelle piante, tutte le cellule sono tenute in posizione attraverso pareti cellulari che costituiscono la base dello scheletro idrostatico²⁶. Per liberare una cellula vegetale da questa matrice, gli scienziati hanno fisicamente tagliato la cellula dal tessuto circostante attraverso la microdissezione di cattura laser (LCM)²⁷ o eseguito la digestione enzimatica delle pareti cellulari²⁸. Tra queste ultime cellule, le cosiddette protoplasts, la popolazione di interesse è fluorescente etichettata e può essere separata tramite lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS)⁷. LCM di solito richiede un campione da fissare e incorporare nella cera, che alla fine deteriora la qualità del suo RNA²⁹. I metodi basati su FACS producono RNA di alta qualità, ma il processo di protoplasting stesso introduce differenze nell’espressione genica³⁰ e i tessuti con pareti cellulari secondarie modificate e spesse sono notoriamente difficili da trattare. Inoltre, si presume che molti processi di sviluppo negli impianti si basino su segnali trasmessi meccanicamente e quindi l’integrità della parete cellulare è di fondamentale importanza³¹. Due metodi, che utilizzano una scorciatoia per aggirare l’isolamento cellulare operando a livello di nucleii, sono lo smistamento nucleare attivato dalla fluorescenza (FANS) e l’isolamento dei nuclei taggati in specifici tipi di cellule (INTACT). Come nel TRAP, usano promotori specifici del tipo di cellula per contrassegnare i nuclei, che successivamente si arricchiscono tramite ordinamento o discesa, rispettivamente^8,15. Una grande sfida per tutti questi approcci è ottenere sufficiente materiale di RNA da sottoinsiemi di cellule in un tessuto. Poiché TRAP cattura solo una frazione degli RNA cellulari, la raccolta dei campioni è un notevole collo di bottiglia. Pertanto, sono necessari protocolli di preparazione della libreria particolarmente sensibili per produrre dati di alta qualità da quantità di input basse.

Dalla sua istituzione, TRAP è stato utilizzato in combinazione con microarray di DNA o, come i costi di sequenziamento è sceso in modo significativo negli ultimi anni, RNA-seq^10,32,33. Una moltitudine di domande di ricerca è già stato chiarito come esaminato in Sablok et al.³⁴. Siamo convinti che nei prossimi anni seguiranno ulteriori rapporti, poiché la tecnica è molto versatile quando si combinano diversi promotori per indirizzare tipi di cellule specifici. Alla fine, questo sarà fatto anche in modo inducibile, e può essere combinato con sondare la reazione della pianta a molti fattori di stress biotici e abiotici. Inoltre, laddove non sono disponibili linee transgeniche stabili, sono stati utilizzati con successo anche sistemi di espressione delle radici pelose per eseguire trap in pomodoro e medicago^35,36.

Figura 1: La traduzione della purificazione dell’affinità del ribosomiare (TRAP) integra il portafoglio di analisi “omiche”. R. L’aumento dei livelli di precisione analitica, fino alla risoluzione a cella singola o addirittura subcellulare, può essere raggiunto con una pletora di metodi o combinazioni. Il sistema fornisce una panoramica degli strumenti attualmente disponibili nel campo delle piante e degli animali. La raccolta dei tessuti a risoluzione cellulare può essere ottenuta da protocolli come LCM o FACS, che vengono poi accoppiati a trascrittoma standard o all’analisi di profilazione/traslatoma polisomico. TRAP e INTACT integrano sia la cattura dei tessuti che l’isolamento dell’RNA in quanto si basano sull’epitope-tagging. Tuttavia, INTACT campiona solo i nuclei cellulari e costituisce, quindi, un caso speciale di analisi del trascrittoma. Una piccola icona coniglio segna metodi appena sviluppati nel campo animale: Mentre SLAM-ITseq e Flura-seq si basano sul targeting metabolico di RNA nascenti con basi uracili modificate in cellule che esprimono l’enzima permissivo, Slide-seq fa uso di un vetrino di vetro rivestito con codici a barre del DNA che forniscono informazioni posizionali nella gamma cellulare. In APEX-seq è seguito un approccio di etichettatura di prossimità per campionare gli RNA in specifici compartimenti subcellulari. In particolare, una maggiore risoluzione spesso richiede la generazione di materiale transgenico (asterischi) e questi metodi sono quindi utilizzati prevalentemente per le specie modello. Il TRAP è particolarmente adatto per studi di scienze vegetali che coinvolgono la parete cellulare (CW) o la segnalazione meccanica, nonché le specie cellulari che sono difficili da rilasciare dalla loro matrice CW. B. Le fasi dettagliate del laboratorio umido della procedura TRAP: le piantine che esprimono proteine ribosomiche marcate GFP in tipi di cellule distinte (ad esempio l’endodermide delle radici) vengono coltivate sui piatti Petri per sette giorni e il materiale delle radici raccolto dal congelamento a scatto. Un campione totale di controllo dell’RNA viene raccolto dall’estratto grezzo omogeneo prima di pellere i detriti attraverso la centrifugazione. Perline magnetiche anti-GFP vengono aggiunte all’estratto eliminato per eseguire l’immunoprecipitazioni. Dopo l’incubazione e tre fasi di lavaggio, l’RNA associato al poliso (TRAP/RNA polisopo) viene ottenuto direttamente tramite l’estrazione del fenolo-cloroformio. LCM: microdissezione di cattura laser, FACS/FANS: smistamento cellulare/nucleare attivato dalla fluorescenza, APEX-seq: metodo basato su ingegnerizzato ascorbate perossidasi, INTACT: isolamento dei nuclei contrassegnati in specifici tipi di cellule, SLAM-ITseq: thiol(SH)-linked alchilirazione per il sequenziamento metabolico dell’RNA nel tessuto, Flura-seq: fluorouracil-labeled RNA sequencing (Creato con Biorender.com) Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

L’obiettivo di questo articolo è fornire una descrizione dettagliata del metodo TRAP, evidenziare i passaggi critici e fornire indicazioni per un possibile metodo di preparazione della libreria.

Un esperimento trap generico consisterà essenzialmente nei seguenti passi (vedi anche Figura 1B): (1) Preparazione del materiale vegetale, compresa la clonazione del costrutto di ribosomi, la produzione e la selezione di linee transgeniche, la coltivazione e l’accumulo di semi, la sterilizzazione e la placcatura e l’applicazione/trattamento dello stress (opzionale) e la raccolta dei tessuti; (2) immunopurificazione, compresa l’omogenesi e la bonifica dei tessuti, il lavaggio delle perline e l’immunopurificazione e le fasi di lavaggio; (3) Estrazione dell’RNA e valutazione della qualità; e (4) la preparazione della biblioteca.

La radice dell’Arabidopsis è stata un sistema modello per studiare lo sviluppo delle piante sin dalla sua introduzione come impianto modello^37,38. Qui, l’applicazione di TRAP è presentata nel contesto dello sviluppo delle radici laterali dell’impianto. Nelle piante, l’accumulo dell’intero sistema radicale si basa sull’esecuzione di questo programma ed è quindi molto importante per la sopravvivenza dell’organismo³⁹. In Arabidopsis, le radici laterali provengono dal tessuto periciclo che risiede accanto ai vasi xylem e quindi è chiamato xylem polo periciclo (XPP; vedi Figura 2C)⁴⁰. Alcune cellule XPP, che si trovano in profondità all’interno della radice, acquisiscono un’identità cellulare fondatore e, su un trigger ormonale locale, iniziano a proliferare gonfiore e dividendo anticlinally⁴¹. Tuttavia, a causa della presenza di una matrice rigida della parete cellulare, questo processo esercita uno stress meccanico sui tessuti circostanti. In particolare, l’endodermide sovrastante è interessata, in quanto è nel modo dell’asse di crescita della radice laterale^42,43,44. Infatti, il primordio appena formato dovrà crescere attraverso la cellula endodermide sovrastante (Figura 2C2) mentre le cellule corteccia ed epidermide sono solo spinte da parte per il primordio per emergere finalmente^45,46. Recenti lavori nel nostro laboratorio hanno dimostrato che l’endodermide sta contribuendo attivamente ad accogliere la proliferazione nel periciclo. Il blocco mirato della segnalazione ormonale endodermica è sufficiente per inibire anche la prima divisione nelle cellule XPP⁴⁷. Pertanto, la comunicazione pericycle-endodermis costituisce un checkpoint molto precoce per lo sviluppo della radice laterale nell’Arabidopsis. Tuttavia, non è noto come questo crosstalk viene eseguito. Per svelare questo mistero, abbiamo scelto l’approccio TRAP-seq per colpire XPP e cellule endodermiche. Per arricchire per le cellule nel programma della radice laterale, abbiamo imitato il trigger ormonale applicando esogenamente un analogo auxina (1-naftaleneacetic acid, NAA)⁴⁸, che allo stesso tempo ha permesso di risolvere temporaneamente la fase iniziale di formazione della radice laterale.

Protocol

1. Clonazione di transgenici, produzione e selezione di linee transgeniche Clonare il promotore di scelta nel vettore di immissione appropriato. Utilizzare un metodo di clonazione basato sulla ricombinazione (Table of Materials) e ricombinare i promotori in pDONRP4-P1r. Clone RPL18 (con tag di affinità o proteina fluorescente prescelta) utilizzando la clonazione basata sulla ricombinazione in pDONRP1-P249. Combinare il vettore di ingresso contenente RPL18<…

Representative Results

Per la valutazione della qualità, la procedura di cui sopra dovrebbe essere sondata in diversi passaggi intermedi: convalida del modello di espressione nella planta, controllo qualità dell’RNA polisomico isolato e delle librerie finali. QRT-PCR utilizzando geni marcatori noti può, inoltre, essere eseguito per confermare la risposta alla condizione di trattamento o per mettere a punto le condizioni sperimentali. Analis…

Discussion

Verifica del modello di localizzazione RPL18
Fondamentale per evitare interpretazioni errate dei dati di qualsiasi esperimento TRAP è il modello di espressione corretto della sottounità ribosomica con tag. Pertanto, l’incorporazione di GFP come tag epitope a RPL18 consente molto elegantemente la verifica del modello di espressione desiderato e consecutivamente, la pulldown della frazione polisoma dallo stesso tessuto. Approcci più invasivi per assicurare modelli di promotore adeguati sono seguiti d…

Materials

Sterilization
bleach, 13%	Sigma	71696
beaker	VWR	214-1172/74/75
desiccator with porcelaine plate (DURAN)	Sigma/Merck	Z317454-1EA/Z317594-1EA
EtOH, p.a.	Honeywell	02860-1L
HCl, 37%	Roth	4625.1
Tween 20	Sigma	P9416
Plate growth + harvesting
MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer	Duchefa	M0254
agar plant for cell culture	Applichem/Panreac	A2111.1000
DMSO	Sigma	D4540
forcepts	Rubis Switzerland	5-SA model
KOH	Fluka	60370
micropore/surgical tape	3M	1530-0
NAA	Duchefa	N0903
petri dishes 120×120 mm	Greiner bio-one	688102
scalpel	VWR/Swann-Morton	233-5454
tissues, neutral, two-layered			any supplier of your choice
Immunoprecipitation
GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA	Chromotek	e.g. gtma-100
Brij-35	Sigma	P1254-500G
centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)	Beckman Coulter	357001
Chloramphenicol	Applichem	C0378-25G
cotton gloves	VWR	113-7355
Cycloheximide, HPLC grade	Sigma	01810-1G
DEPC	VWR	E174	might have long delivery times
DTT	Fluka	43815
EGTA	Sigma	3054.3
homogenizers DUALL 23	KONTES GLASS CO (via VWR)	SCERSP885450-0023 (set)	SCERSP885451-0023 pestle only – SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times
Igepal CA-360	Sigma	I3021-100ml
KCl	Sigma	60130
MgCl2 hexahydrat	Roth	2189.2
mortar and pestle	VWR	470148-960 & 470019-978
PMSF	Roche	10 837 091 001
Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE	Sigma	P2393-500G
RNase-free water	Roth	T143.3
RNAZap	Thermo Fisher	AM9780/AM9782	for cleaning surfaces
Tris, >99.3%	Roth	AE15.3
Triton X-100	Fluka	T8787-250ml
Tween 20	Sigma	P9416-100ml
RNA extraction
2-Propanol, p.a.	Sigma	33539-1L-GL-R
Chloroform, HPLC grade	Scharlau	CL02181000
EtOH, p.a.	Honeywell	02860-1L
low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml	Eppendorf/Sigma	Z666548-250EA	LoBind
RNase-free DNase set	Qiagen	79254
RNeasy MiniElute Cleanup Kit	Qiagen	74204
TRIzol reagent	ThermoFisher/Ambion	15596018
Library preparation
15/50 mL Tube Magnetic Separator	Abraxis	PN 472250
AMPure beads	Beckman Coulter	A63881
Index Kit A	Illumina	FC-131-2001
Index Kit D	Illumina	FC-131-2004
neodymium magnets	Amazon/other	6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)
Nextera XT kit	Illumina	FC-131-1024/1096	https://emea.support.illumina.com/
PCR strips	ThermoScientific	AB-0266
SMARTer v4 kit	Takara Bioscience	634892	https://www.takarabio.com/
Bioanalyzer	Agilent	2100 Bioanalyzer Instrument	specialized equipment for RNA/DNA quality control
Tapestation	Agilent	4200 Tapestation Instrument	specialized equipment for RNA/DNA quality control
Fragment Analyzer	Agilent	5400 Fragment Analyzer System	specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
LabChip	PerkinElmer	LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer	specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
Qubit 4 Fluorometer	ThermoFisher	Q33239	specialized equipment for RNA/DNA concentration determination
qRT-PCR
GATA23	Microsynth		fwd: AGTGAGAATGAA AGAAGAGAAGGG; rev: GTGGCTGCGAAT AATATGAATACC
GH3.3	Microsynth		fwd: CAAACCAATCCT CCAAATGAC; rev: ACTTATCCGCAA CCCGACT
LBD29	Microsynth		fwd: TCTCCAACAACA GGTTGTGAAT; rev: AAGGAGCCTTAG TAGTGTCTCCA
UBC21	Microsynth		fwd: TGCGACTCAGGG AATCTTCT; rev: TCATCCTTTCTT AGGCATAGCG
SsoAdvanced Universal SYBR Green	Bio-Rad	#172-5270
iScript Adv cDNA Kit	Bio-Rad	#172-5038
miscellaneous
Falcon tubes 15 ml, Cellstar	Greiner bio-one	188261
Falcon tubes 50 ml, Cellstar	Greiner bio-one	210261
filter tips 1 ml	Axygen	TF-1000-R-S
filter tips 10 µl	Axygen	TF-10-R-S
filter tips 100 µl	Axygen	TF-100-R-S
filter tips 20 µl	Axygen	TF-20-R-S
filter tips 200 µl	Axygen	TF-200-R-S
microcentrifuge tubes 1.5 ml	SARSTEDT	72.690.001
Propidium iodide	Sigma	P4170-100MG
sequencing company	Novogene		en.novogene.com