Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate <em>Arabidopsis thaliana</em> Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Martha Thellmann; Tonni  Grube Andersen; Joop  EM Vermeer

doi:10.3791/60919

JoVE Journal > Developmental Biology

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Biologie du développement

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

Published: May 14, 2020

doi:

10.3791/60919

Martha Thellmann, Tonni Grube Andersen, Joop EM Vermeer³

¹Department of Plant and Microbial Biology,University of Zurich, ²Biophore – UNIL, ³Laboratory of Cell and Molecular Biology, Institute of Biology,University of Neuchâtel

Summary

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 장기와 조직의 최소한의 처리로 개발 프로그램을 해부할 수 있습니다. 이 프로토콜은 녹색 형광 단백질(GFP)으로 표적화된 세포로부터 고품질의 RNA를 산출합니다. qRT-PCR 또는 RNA-seq와 같은 다운스트림 분석 도구는 조직 및 세포 유형별 발현 프로파일을 밝힙습니다.

Abstract

이 기사에서는 번역 리보솜 친화도 정제 (TRAP) 방법 및 연속최적화 된 낮은 입력 라이브러리 준비를 통해 상이한 애기장대 탈리아나 루트 세포 유형에서 translatome 데이터를 얻기 위한 실습 지침을 제공합니다.

시작 재료로서, 우리는 적절한 프로모터를 사용하여 세포 유형별 방식으로 GFP 태그리보소말 단백질 RPL18을 발현하는 식물 라인을 사용합니다. 면역 정화 및 RNA 추출 전에 조직은 고정되어 조직 무결성을 보존하고 동시에 높은 시간적 해상도로 타임 시리즈 연구를 실행할 수 있습니다. 특히, 세포벽 구조는 손상되지 않은 상태로 남아 있으며, 이는 뚜렷한 세포 집단을 분리하기 위해 조직 에 의존하는 형광 활성화 세포 선별 기반 접근법과 같은 대체 절차의 주요 단점입니다. 또한 고품질 RNA를 얻을 수 있는 레이저 포획 미세 해부 기반 기술에서와 같이 조직 고정이 필요하지 않습니다.

그러나, 세포의 하위 집단에서 샘플링만 폴리섬 관련 RNA를 격리하는 것은 RNA 수율을 심각하게 제한합니다. 따라서 RNA-seq에 의한 성공적인 데이터 수집을 위해 충분히 민감한 라이브러리 준비 방법을 적용해야 합니다.

TRAP은 세포벽 관련 및 기계적 신호 경로와 관련된 많은 개발 공정으로 플랜트 연구에 이상적인 도구를 제공합니다. 특정 세포 집단을 표적으로 하는 프로모터의 사용은 차례차례로 작은 해결책 또는 아주 높은 비용 때문에 손해를 입는 기관과 단세포 수준 사이 격차를 다리로 입니다. 여기에서, 우리는 측방 루트 형성에 있는 세포 세포 통신을 공부하기 위하여 TRAP를 적용합니다.

Introduction

차세대 염기서열 분석 기술의 응용이 증가함에 따라 개발 생물학의 공간 해상도가 증대될 수 있습니다. 현대 연구는 단세포 수준^1,^2,²^,^3,^,^4가아니라면, 전문화한 세포 모형에 조직을 해부하는 것을 목표로 합니다. 이를 위해, 지난 50년 동안 다양한 방법이 고안되었다(도 1A참조)^5,^6,⁶^,⁷^7,^8,^,^9,^,^10,^,^11,^12,^,^13,^,^14,^,^15.^,

식물 과학의 많은 도구는 동물 연구에서 개척 된 기술의 적응되었습니다. 여기에서 자세히 소개하는 방법은 그렇지 않습니다. 2005년, 단백질 번역에 대한 탄탄한 배경을 갖춘 베일리-세레스 연구소는 후속 친화도 정제^16을위해 리보소말 단백질을 설계하기 시작했습니다. 따라서, 그들은 수크로오스 그라데이션을 가진 초원심분리에 기초하고 1960년대^,^17,^18년이후 리보솜 을 번역하는 데 사용된 시간 소모적이고 노동 집약적인 폴리솜 프로파일링을 피할 수 있었다. 상기 방법은 이후 번역리보솜 친화도 정제(TRAP)^16으로지칭되었다. 식물에서 성공적인 트랜스플라토메 연구 후, Heiman 등은 동물^19에 대한 TRAP을 적용했으며 다른 동물은 효모^20, 초파리^21, 제노푸스²² 및 제브라피시^23,^,^24로적용을 확대했다.

모델 시스템의 유전자 변형은 TRAP의 전제 조건이지만, 이는 유전자 변형에 대한 적용을 제한하는 종에 대한 적용을 제한하지만, 하나는 동시에 특별한 관심과 그렇지 않으면 손상되지 않은 조직 / 기관^(예를 들어, 감염된 식물 에서 마우스 뇌 또는 곰팡이 hyphae에서 고도로 분지 수지상 세포)에서 분리하기 매우 어려운 세포의 하위 세트를 대상으로이 반대를 활용할 수 있습니다. 식물에서, 모든 세포는 정수체^{골격(26)의}기초를 형성하는 세포벽을 통해 제자리에 유지된다. 이 매트릭스에서 식물 세포를 해방하기 위하여는, 과학자는 레이저 포획 미세 분부 (LCM)^27를 통해 그 주변 조직에서 세포를 물리적으로 잘라내거나 세포벽^28의효소 소화를 수행했습니다. 후자의 세포 들 중, 소위 프로토 플라스타체, 관심있는 집단은 형광 표지되고 형광 활성화 세포 선별(FACS)^7을통해 분리될 수 있다. LCM은 일반적으로 그것의 RNA^29의질을 궁극적으로 악화시키는 왁스에서 고정되고 매립되는 견본을 요구합니다. FACS 기반 방법은 고품질 RNA를 산출하지만, 프로토라스팅 자체의 과정은 유전자 발현^30의 차이를 도입하고 변형되고 두꺼운 이차 세포벽을 가진 조직은 치료하기가 악명 이어 있다. 더욱이, 식물의 많은 발달 공정은 기계적으로 전송된 신호에 의존하는 것으로 가정되므로 세포벽의 무결성이 가장 중요하다^31. 핵의 수준에서 작동하여 세포 격리를 우회하기 위해 바로 가기를 사용하는 두 가지 방법은 형광 활성화 핵 선별 (FANS) 및 특정 세포 유형 (INTACT)에 태그 된 핵의 분리입니다. TRAP에서와 같이, 그(것)들은 핵을 표시하기 위하여 세포 유형 특정 프로모터를 이용하고, 그 후에 분류를 통해 농축되거나, 각각^8,^,^15. 이 모든 접근을 위한 중요한 도전은 조직에 있는 세포의 부분 집합에서 충분한 RNA 물자를 얻는 것입니다. TRAP이 셀룰러 RNA의 일부만 캡처하므로 샘플 수집은 상당한 병목 현상입니다. 따라서 낮은 입력 량에서 고품질 데이터를 생성하려면 특히 중요한 라이브러리 준비 프로토콜이 필요합니다.

설립 이래, TRAP은 DNA 마이크로어레이와 병용되어 사용되거나, 시퀀싱 비용이 최근 몇 년 동안 현저히 감소함에 따라, RNA-seq^10,^,^32,^,^33. 연구 질문의 무리는 이미 사블락 등에서 검토로 해명되었습니다³⁴. 우리는 기술이 특정 세포 모형을 표적으로 하기 위하여 다른 프로모터를 결합할 때 아주 다재다능하기 때문에 앞으로 더 많은 보고가 따를 것이라는 점을 확신합니다. 결국, 이것은 유도 할 수있는 방법으로도 수행 될 것이며, 많은 생물학적 및 비생물적 스트레스 요인에 대한 식물의 반응을 조사하는 것으로 결합 될 수 있습니다. 또한, 안정적인 형질전환라인을 사용할 수 없는 곳에서는, 털이 많은 뿌리 발현 시스템도 토마토와^{메디아고(35,}^,^36)에서TRAP을 수행하는 데 성공적으로 사용되었다.

그림 1: 리보솜 친화성 정제(TRAP)를 번역하는 것은 “오믹스” 분석 포트폴리오를 보완합니다. A. 분석 정밀도의 증가 수준, 단일 세포 또는 심지어 세포 이하 의 해상도는 이들의 방법 또는 조합의 과다에 의해 달성 될 수있다. 이 계획은 식물과 동물 분야에서 현재 사용 가능한 도구의 개요를 제공합니다. 세포 결정에서 조직 수집은 LCM 또는 FACS와 같은 프로토콜에 의해 달성 될 수 있으며, 표준 전사체 또는 폴리섬 프로파일링 / 트랜스 라토메 분석과 결합됩니다. TRAP 과 INTACT는 에피토프 태깅을 기반으로 조직 캡처 및 RNA 격리를 모두 통합합니다. 그러나, INTACT 는 세포 핵만을 샘플링하고, 따라서, 전사체 분석의 특별한 경우를 구성한다. 작은 토끼 아이콘은 동물 분야에서 새로 개발 된 방법을 표시 : SLAM-ITseq 및 Flura-seq는 허용 효소를 발현하는 세포에서 수정 된 우라실 염기를 가진 초기 RNAs의 대사 지색에 의존하는 반면, Slide-seq는 세포 범위에서 위치 정보를 제공하는 DNA 바코드가있는 코팅 된 유리 슬라이드를 사용합니다. 근접 라벨링 접근법은 APEX-seq에서 특정 세포 외 구획에서 RNA를 샘플링하는 방법을 따릅니다. 특히, 증가 된 해상도는 종종 형질전환 물질 (별표)의 생성을 필요로하고 이러한 방법은 따라서 주로 모델 종에 사용된다. TRAP은 특히 CW 매트릭스에서 방출하기 어려운 세포종뿐만 아니라 세포벽(CW) 또는 역학 신호와 관련된 식물 과학 연구에 적합합니다. B. TRAP 절차의 상세한 습식 실험실 단계: GFP 태그가 달린 리보좀 단백질을 구별된 세포 유형(예: 뿌리 내피)에서 발현하는 모종은 7일 동안 페트리 접시에서 재배되고 스냅 동결에 의해 수확된 뿌리 재료입니다. 총 RNA 제어 샘플은 원심 분리를 통해 파편을 펠릿하기 전에 균질화된 원유 추출물로부터 수집됩니다. 자기 항-GFP 비드는 면역 침전을 수행하기 위해 클리어된 추출물에 첨가된다. 배양 및 3개의 세척 단계 후, 폴리솜 관련 RNA(TRAP/폴리솜 RNA)는 페놀-클로로포름 추출을 통해 직접 수득된다. LCM : 레이저 캡처 미세 해부, FACS / 팬 : 형광 활성화 세포 / 핵 선별, APEX-seq: 엔지니어링 된 아스코르브 인 과산화제에 기초한 방법, INTACT: 특정 세포 유형에 태그 된 핵의 격리, SLAM-ITseq: THIOL(SH)-조직내 RNA의 대사 시퀀싱에 대한 연결 알킬레이션, 플루라-세크: 플루라-세크: 플루라-세크: 플루오라실 라벨RNA 시퀀싱(Biorender.com 이쪽을 클릭하십시오.

이 문서의 목표는 TRAP 메서드에 대한 자세한 설명을 제공하고 중요한 단계를 강조 표시하고 가능한 라이브러리 준비 방법에 대한 지침을 제공하는 것입니다.

일반 TRAP 실험은 본질적으로 다음 단계로 구성됩니다 (도 1B참조) ( (1) 리보솜 태깅 구조의 복제, 형질 전환 라인 생산 및 선택, 씨앗의 성장 및 벌킹, 살균 및 도금, 스트레스 적용 / 치료 (선택 사항) 및 조직 수확을 포함한 식물 재료의 준비; (2) 조 추출물의 조직 균질화 및 개간, 비드 세척 및 면역정화, 및 세척 단계를 포함하는 면역화; (3) RNA 추출 및 품질 평가; (4) 도서관 준비.

애기장대 뿌리는 모델 플랜트^37,^,^38으로도입된 이래 식물 개발을 연구하는 모델 시스템이다. 여기서 TRAP의 적용은 식물 측면 루트 개발의 맥락에서 전시된다. 식물에서 전체 루트 시스템의 축적은이 프로그램의 실행에 의존하므로 유기체^(39)의생존에 매우 중요합니다. 애기장대에서,측면 뿌리는 자일렘 혈관 옆에 상주하는 pericycle 조직에서 유래하고 따라서 자일렘 극 페리사이클이라고합니다 (XPP; 그림 2C참조)^40. 뿌리 안쪽 깊숙이 위치한 일부 XPP 세포는 설립자 세포 정체성을 얻고 국소 호르몬 트리거에 따라 팽창과 반대로^41을나누어 증식하기 시작합니다. 그러나 단단한 세포벽 매트릭스가 존재하기 때문에이 과정은 주변 조직에 기계적 응력을 가합니다. 특히, 횡근근성장축(42,^,^43,^,⁴²^44)의방식이기 때문에, 과도내피증이 영향을 받는다. 실제로, 새로 형성된 프리모르듐은 지나치게 내피세포(도2C2)를통해 성장해야 하는 반면 피질과 표피 세포는 프리모르듐이 마침내^45,^,^46으로나타난다. 우리의 실험실에 있는 최근 일은 내분비가 pericycle에 있는 확산을 수용하기 위하여 적극적으로 기여하고 있다는 것을 보여주었습니다. 내피 호르몬 신호의 표적 차단은 XPP^{세포(47)에서의}제1 분열조차도 억제하기에 충분하다. 따라서, pericycle-endodermis 통신은 애기장대에서측근 발달을 위한 아주 초기 체크포인트를 구성합니다. 그러나 이 크로스토크가 어떻게 수행되는지는 알 수 없습니다. 이 수수께끼를 풀기 위해 XPP 및 내피 세포를 대상으로 하는 TRAP-seq 접근법을 선택했습니다. 측면 루트 프로그램에서 세포를 풍부하게하기 위해, 우리는 외인성으로 auxin 아날로그를 적용하여 호르몬 트리거를 모방 (1-naphthaleneacetic 산, NAA)^48,이는 동시에 일시적으로 측면 루트 형성의 초기 단계를 해결 허용.

Protocol

1. 이식 유전자의 복제, 형질전환 라인 생산 및 선택 적절한 엔트리 벡터에서 선택된 프로모터를 복제한다. 재조합 계 클론방법(표 오브 머티리얼)을사용하고 pDONRP1-P249에서재조합 기반 복제를 사용하여 pDONRP4-P1r. 클론 RPL18(선호도 태그 또는 선택의 형광 단백질 포함)에서 프로모터를 재결합한다. RPL18을 함유하는 엔트리 벡터를 프로모터-함유 진…

Representative Results

품질 평가를 위해, 전술한 절차는 몇 가지 중간 단계에서 조사되어야 한다: 질라에서의 발현 패턴 검증, 단리된 다각형 RNA의 품질 관리뿐만 아니라 최종 라이브러리. 공지된 마커 유전자를 이용한 qRT-PCR은, 또한, 치료 조건에 대한 반응을 확인하거나 실험 조건을 미세 조정하기 위해 수행될 수 있다. GFP 신호 분포의 공초?…

Discussion

RPL18 현지화 패턴 검증
TRAP 실험에서 데이터의 잘못된 해석을 방지하는 데 중요한 것은 태그가 지정된 리보소말 소단위의 적절한 발현 패턴입니다. 따라서, RPL18에 에피토프 태그로서 GFP의 혼입은 매우 우아하게 동일한 조직에서 다각성 분획의 원하는 발현 패턴 및 연속적으로, 풀다운의 검증을 가능하게 한다. 적절한 프로모터 패턴을 보장하기 위한 보다 침습적인 접근법은 Jiao 및 M…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는이 프로젝트의 초기 단계에서 중요한 전문가 조언을 취리히 유전 다양성 센터의 장 클로드 Walser에 감사드립니다. Vermeer 연구소의 작업은 SNF 교수 직교 보조금(PP00P3_157524)과 JEMV에 수여된 스위스 국립 과학 재단(SNSF)의 R’EQUIP 장비 보조금(316030_164086)에 의해 지원되었습니다.

Materials

Sterilization
bleach, 13%	Sigma	71696
beaker	VWR	214-1172/74/75
desiccator with porcelaine plate (DURAN)	Sigma/Merck	Z317454-1EA/Z317594-1EA
EtOH, p.a.	Honeywell	02860-1L
HCl, 37%	Roth	4625.1
Tween 20	Sigma	P9416
Plate growth + harvesting
MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer	Duchefa	M0254
agar plant for cell culture	Applichem/Panreac	A2111.1000
DMSO	Sigma	D4540
forcepts	Rubis Switzerland	5-SA model
KOH	Fluka	60370
micropore/surgical tape	3M	1530-0
NAA	Duchefa	N0903
petri dishes 120×120 mm	Greiner bio-one	688102
scalpel	VWR/Swann-Morton	233-5454
tissues, neutral, two-layered			any supplier of your choice
Immunoprecipitation
GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA	Chromotek	e.g. gtma-100
Brij-35	Sigma	P1254-500G
centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)	Beckman Coulter	357001
Chloramphenicol	Applichem	C0378-25G
cotton gloves	VWR	113-7355
Cycloheximide, HPLC grade	Sigma	01810-1G
DEPC	VWR	E174	might have long delivery times
DTT	Fluka	43815
EGTA	Sigma	3054.3
homogenizers DUALL 23	KONTES GLASS CO (via VWR)	SCERSP885450-0023 (set)	SCERSP885451-0023 pestle only – SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times
Igepal CA-360	Sigma	I3021-100ml
KCl	Sigma	60130
MgCl₂ hexahydrat	Roth	2189.2
mortar and pestle	VWR	470148-960 & 470019-978
PMSF	Roche	10 837 091 001
Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE	Sigma	P2393-500G
RNase-free water	Roth	T143.3
RNAZap	Thermo Fisher	AM9780/AM9782	for cleaning surfaces
Tris, >99.3%	Roth	AE15.3
Triton X-100	Fluka	T8787-250ml
Tween 20	Sigma	P9416-100ml
RNA extraction
2-Propanol, p.a.	Sigma	33539-1L-GL-R
Chloroform, HPLC grade	Scharlau	CL02181000
EtOH, p.a.	Honeywell	02860-1L
low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml	Eppendorf/Sigma	Z666548-250EA	LoBind
RNase-free DNase set	Qiagen	79254
RNeasy MiniElute Cleanup Kit	Qiagen	74204
TRIzol reagent	ThermoFisher/Ambion	15596018
Library preparation
15/50 mL Tube Magnetic Separator	Abraxis	PN 472250
AMPure beads	Beckman Coulter	A63881
Index Kit A	Illumina	FC-131-2001
Index Kit D	Illumina	FC-131-2004
neodymium magnets	Amazon/other	6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)
Nextera XT kit	Illumina	FC-131-1024/1096	https://emea.support.illumina.com/
PCR strips	ThermoScientific	AB-0266
SMARTer v4 kit	Takara Bioscience	634892	https://www.takarabio.com/
Bioanalyzer	Agilent	2100 Bioanalyzer Instrument	specialized equipment for RNA/DNA quality control
Tapestation	Agilent	4200 Tapestation Instrument	specialized equipment for RNA/DNA quality control
Fragment Analyzer	Agilent	5400 Fragment Analyzer System	specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
LabChip	PerkinElmer	LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer	specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
Qubit 4 Fluorometer	ThermoFisher	Q33239	specialized equipment for RNA/DNA concentration determination
qRT-PCR
GATA23	Microsynth		fwd: AGTGAGAATGAA AGAAGAGAAGGG; rev: GTGGCTGCGAAT AATATGAATACC
GH3.3	Microsynth		fwd: CAAACCAATCCT CCAAATGAC; rev: ACTTATCCGCAA CCCGACT
LBD29	Microsynth		fwd: TCTCCAACAACA GGTTGTGAAT; rev: AAGGAGCCTTAG TAGTGTCTCCA
UBC21	Microsynth		fwd: TGCGACTCAGGG AATCTTCT; rev: TCATCCTTTCTT AGGCATAGCG
SsoAdvanced Universal SYBR Green	Bio-Rad	#172-5270
iScript Adv cDNA Kit	Bio-Rad	#172-5038
miscellaneous
Falcon tubes 15 ml, Cellstar	Greiner bio-one	188261
Falcon tubes 50 ml, Cellstar	Greiner bio-one	210261
filter tips 1 ml	Axygen	TF-1000-R-S
filter tips 10 µl	Axygen	TF-10-R-S
filter tips 100 µl	Axygen	TF-100-R-S
filter tips 20 µl	Axygen	TF-20-R-S
filter tips 200 µl	Axygen	TF-200-R-S
microcentrifuge tubes 1.5 ml	SARSTEDT	72.690.001
Propidium iodide	Sigma	P4170-100MG
sequencing company	Novogene		en.novogene.com

References

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Citer Cet Article

Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale. J. Vis. Exp. (159), e60919, doi:10.3791/60919 (2020).