Traduzindo a Purificação da Afinidade ribossófica (TRAP) para investigar o desenvolvimento raiz arabidopsis thaliana em uma escala específica de tipo de célula

Summary

Traduzir purificação de afinidade costela (TRAP) oferece a possibilidade de dissecar programas de desenvolvimento com processamento mínimo de órgãos e tecidos. O protocolo produz RNA de alta qualidade a partir de células direcionadas com uma subunidade ribossômica rotulada como proteína fluorescente verde (GFP). Ferramentas de análise a jusante, como qRT-PCR ou RNA-seq, revelam perfis de expressão específicos de tecido e célula.

Abstract

Neste artigo, damos instruções práticos para obter dados translatome de diferentes tipos de células radiculares Arabidopsis thaliana através do método de purificação de afinidade costelado (TRAP) traduzindo e preparação consecutiva de biblioteca otimizada otimizada.

Como material inicial, empregamos linhas de plantas que expressam a proteína ribossômica RPL18 com gfp de forma específica do tipo celular, utilizando promotores adequados. Antes da imunopurificação e extração de RNA, o tecido é congelado, o que preserva a integridade do tecido e permite simultaneamente a execução de estudos de séries temporais com alta resolução temporal. Notavelmente, as estruturas de parede celular permanecem intactas, o que é uma grande desvantagem em procedimentos alternativos, como abordagens baseadas em triagem celular ativadas por fluorescência que dependem de protoplasting tecidual para isolar populações celulares distintas. Além disso, nenhuma fixação tecidual é necessária como em técnicas baseadas em microdissecção de captura a laser, o que permite obter RNA de alta qualidade.

No entanto, a amostragem de subpopulações de células e apenas o RNA associado ao polisome severamente limita severamente os rendimentos de RNA. É, portanto, necessário aplicar métodos suficientemente sensíveis de preparação de bibliotecas para a aquisição bem-sucedida de dados pelo RNA-seq.

O TRAP oferece uma ferramenta ideal para a pesquisa de plantas, pois muitos processos de desenvolvimento envolvem vias de sinalização mecânica e relacionadas à parede celular. O uso de promotores para atingir populações celulares específicas está fazendo a ponte entre o nível de órgãos e células únicas que, por sua vez, sofrem de pouca resolução ou custos muito altos. Aqui, aplicamos TRAP para estudar a comunicação celular-célula na formação de raízes laterais.

Introduction

Impulsionada pela crescente aplicação de técnicas de sequenciamento de última geração, a resolução espacial na biologia do desenvolvimento poderia ser aumentada. Estudos contemporâneos visam dissecar tecidos para tipos de células especializadas, se não o nível de célulaúnica^11,2,,3,4. Para isso, uma infinidade de métodos diferentes foi concebida ao longo dos últimos cinquenta anos (ver Figura 1A)^{5,6,,7,,688,99,10,,11,,12,,13,,14,15}.

Muitas ferramentas em ciência vegetal têm sido adaptações de técnicas que foram pioneiras na pesquisa animal. Este não é o caso para o método que estamos introduzindo em detalhes aqui. Em 2005, equipado com uma forte formação em tradução de proteínas, o Laboratório Bailey-Serres começou a projetar proteínas ribossômicas para posterior purificação de afinidade¹⁶. Assim, poderiam evitar o demorado e intensivo em perfil de polisério, que se baseia na ultracentrifugação com um gradiente de sacarose e foi utilizado para avaliar ribossomos traduzidos desde a década de 1960^17,18. Desde então, o método foi referido como purificação de afinidade de ribossomos traláricos (TRAP)¹⁶. Após estudos bem-sucedidos de translatome em plantas, Heiman et al. adaptaram TRAP para animais¹⁹ e outros estenderam sua aplicação para leveduras²⁰, Drosophila²¹, Xenopus²² e zebrafish^23,24.

Embora a modificação genética do sistema modelo seja um pré-requisito para trap, que limita sua aplicação a espécies passíveis de transformação genética, pode-se simultaneamente aproveitar essa objeção para atingir subconjuntos de células que são de interesse especial e de outra forma extremamente difíceis de isolar do tecido/órgão intacto²⁵ (por exemplo, células dendríticas altamente ramificadas em um cérebro de camundongos ou hifas fúngicas em tecido vegetal infectado). Nas plantas, todas as células são mantidas no lugar através de paredes celulares que formam a base do esqueleto hidrostático²⁶. Para libertar uma célula vegetal dessa matriz, os cientistas cortaram fisicamente a célula de seu tecido circundante através da microdissecção de captura a laser (LCM)²⁷ ou realizaram digestão enzimática das paredes celulares²⁸. Entre as últimas células, os chamados protoplastos, a população de interesse é fluorescentemente rotulada e pode ser separada por meio da triagem celular ativada por fluorescência (FACS)⁷. O LCM geralmente requer uma amostra para ser fixada e embutida em cera, o que acaba por deteriorar a qualidade do seu RNA²⁹. Os métodos baseados em FACS produzem RNA de alta qualidade, mas o processo de protoplasting em si introduz diferenças na expressão genética³⁰ e tecidos com paredes de células secundárias modificadas e grossas são notoriamente difíceis de tratar. Além disso, muitos processos de desenvolvimento nas plantas são assumidos para contar com sinais mecanicamente transmitidos e, portanto, a integridade da parede celular é de suma importância³¹. Dois métodos, que utilizam um atalho para contornar o isolamento celular operando no nível de núcleos, são a triagem nuclear ativada por fluorescência (FANS) e o isolamento de núcleos marcados em tipos de células específicas (INTACT). Como no TRAP, eles usam promotores específicos do tipo celular para marcar núcleos, que posteriormente são enriquecidos através da classificação ou puxar para baixo, respectivamente^8,15. Um grande desafio para todas essas abordagens é obter material de RNA suficiente de subconjuntos de células em um tecido. Como o TRAP captura apenas uma fração dos RNAs celulares, a coleta de amostras é um gargalo considerável. Portanto, protocolos especialmente sensíveis de preparação de bibliotecas são necessários para produzir dados de alta qualidade a partir de baixas quantidades de entrada.

Desde a sua criação, o TRAP tem sido usado em combinação com micromatrizes de DNA ou, como os custos de sequenciamento caíram significativamente nos últimos anos, RNA-seq^10,32,33. Uma infinidade de questões de pesquisa já foi elucidada como revisada em Sablok et al.³⁴. Estamos convencidos de que mais relatórios serão seguidos nos próximos anos, pois a técnica é muito versátil ao combinar diferentes promotores para atingir tipos específicos de células. Eventualmente, isso será feito mesmo de forma indutível, e pode ser combinado com a sondagem da reação da planta a muitos fatores de estresse bióticos e abióticos. Além disso, quando linhas transgênicas estáveis não estão disponíveis, sistemas de expressão raiz peluda também têm sido usados com sucesso para realizar TRAP em tomate e medicago^35,36.

Figura 1: Traduzir purificação de afinidade de ribossomos (TRAP) complementa o portfólio de análise “ômica”. A. O aumento dos níveis de precisão analítica, até a resolução unicelular ou mesmo subcelular, pode ser alcançado por uma infinidade de métodos ou combinações. O esquema dá uma visão geral das ferramentas disponíveis atualmente no campo vegetal e animal. A coleta de tecidos na resolução celular pode ser alcançada por protocolos como LCM ou FACS, que são então acoplados à transcrição padrão ou análise de perfil/tradução polisome. TRAP e INTACT integram tanto a captura de tecido quanto o isolamento do RNA, pois são baseados na marcação de epítopos. No entanto, intacto amostra apenas núcleos celulares e constitui, portanto, um caso especial de análise de transcriptome. Um pequeno ícone de coelho marca métodos recém-desenvolvidos no campo animal: Enquanto SLAM-ITseq e Flura-seq dependem da segmentação metabólica de RNAs nascentes com bases uracil modificadas em células que expressam a enzima permissiva, Slide-seq faz uso de um slide de vidro revestido com códigos de barras de DNA que fornecem informações posicionais na faixa celular. Uma abordagem de rotulagem de proximidade é seguida em APEX-seq para amostrar RNAs em compartimentos subcelulares específicos. Notavelmente, o aumento da resolução muitas vezes requer a geração de material transgênico (asteriscos) e esses métodos são, portanto, predominantemente utilizados para espécies modelo. Trap é especialmente adequado para estudos de ciência vegetal envolvendo parede celular (CW) ou sinalização mecânica, bem como espécies celulares que são difíceis de liberar de sua matriz CW. B. Etapas detalhadas do laboratório molhado do procedimento TRAP: As mudas que expressam proteína ribossômica marcada por GFP em tipos de células distintas (por exemplo, endoderme raiz) são cultivadas em placas de Petri por sete dias e o material raiz colhido pelo congelamento instantâneo. Uma amostra total de controle de RNA é coletada do extrato bruto homogeneizado antes de pelleting os detritos via centrifugação. Contas anti-GFP magnéticas são adicionadas ao extrato limpo para realizar a imunoprecipitação. Após a incubação e três etapas de lavagem, o RNA associado ao pórnio (Trap/Polysome RNA) é obtido diretamente através da extração de fenol-clorofórmio. LCM: microdissecção de captura a laser, FACS/FANS: célula ativada por fluorescência/classificação nuclear, APEX-seq: método baseado na engenharia de ascorbate peroxidase, INTACT: isolamento de núcleos marcados em tipos de células específicas, SLAM-ITseq: alquilação vinculada ao thiol(SH) para o sequenciamento metabólico de RNA no tecido, Flura-seq: sequenciamento de RNA com rótulo fluorouracil (Criado com Biorender.com) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição detalhada do método TRAP, destacar passos críticos e fornecer orientação para um possível método de preparação da biblioteca.

Um experimento trap genérico consistirá essencialmente nas seguintes etapas (ver também Figura 1B): (1) Preparação de material vegetal incluindo clonagem de construção de marcação de ribossomos, produção e seleção de linhas transgênicas, crescimento e acúmulo de sementes, esterilização e revestimento, e aplicação/tratamento de estresse (opcional) e colheita de tecidos; (2) imunopurificação, incluindo homogeneização tecidual e limpeza do extrato bruto, lavagem de abelhas e imunopurificação, e etapas de lavagem; (3) Extração de RNA e avaliação da qualidade; e (4) preparação da biblioteca.

A raiz arabidopsis tem sido um sistema modelo para estudar o desenvolvimento de plantas desde sua introdução como uma planta modelo^37,38. Aqui, a aplicação do TRAP é apresentada no contexto do desenvolvimento da raiz lateral vegetal. Nas plantas, o acúmulo de todo o sistema radicular depende da execução deste programa e, portanto, é muito importante para a sobrevivência do organismo³⁹. Em Arabidopsis,as raízes laterais originam-se do tecido periciclo que reside ao lado dos vasos xilem e, portanto, é denominado periciclo do pólo xilem (XPP; ver Figura 2C)⁴⁰. Algumas células XPP, que estão localizadas no interior da raiz, adquirem uma identidade celular fundadora e, sobre um gatilho hormonal local, começam a se proliferar por inchaço e divisão anticlinalmente⁴¹. No entanto, devido à presença de uma matriz de parede celular rígida, este processo exerce estresse mecânico nos tecidos circundantes. Em particular, a endoderme sobreposta é afetada, pois está no caminho do eixo de crescimento da raiz lateral^42,43,44. De fato, o primordium recém-formado terá que crescer através da célula endoderme sobreposta (Figura 2C2), enquanto as células córtex e epiderme são apenas deixadas de lado para que o primordium finalmente emerja^45,46. Trabalhos recentes em nosso laboratório mostraram que a endoderme está contribuindo ativamente para acomodar a proliferação no periciclo. O bloqueio direcionado da sinalização hormonal endodérmica é suficiente para inibir até mesmo a primeira divisão nas células XPP⁴⁷. Assim, a comunicação periciclo-endoderme constitui um ponto de verificação muito cedo para o desenvolvimento da raiz lateral na Arabidopsis. No entanto, não se sabe como esse crosstalk é realizado. Para desvendar esse mistério, escolhemos a abordagem TRAP-seq para atingir células XPP e endodérmicas. Para enriquecer para as células no programa raiz lateral, imitamos o gatilho hormonal aplicando exogenously um análogo auxina (1-ácido naftalinacático, NAA)⁴⁸, que ao mesmo tempo permitiu resolver temporalmente a fase inicial da formação da raiz lateral.

Protocol

1. Clonagem de transgene, produção e seleção de linhas transgênicas Clone o promotor de escolha no vetor de entrada apropriado. Use um método de clonagem baseado em recombinação(Tabela de Materiais)e recombine os promotores em pDONRP4-P1r. Clone RPL18 (com etiqueta de afinidade ou proteína fluorescente de escolha) usando clonagem baseada em recombinação em pDONRP1-P249. Combine o vetor de entrada contendo RPL18 com o vetor de entrada contend…

Representative Results

Para avaliação da qualidade, o procedimento acima mencionado deve ser sondado em várias etapas intermediárias: validação de padrão de expressão na planta, controle de qualidade do RNA polissômal oimosois isolado, bem como das bibliotecas finais. qRT-PCR usando genes marcadores conhecidos pode, além disso, ser realizado para confirmar a resposta à condição de tratamento ou para ajustar as condições experimentais. <…

Discussion

Verificação do padrão de localização RPL18
Crucial para evitar má interpretação dos dados de qualquer experimento TRAP é o padrão de expressão adequado da subunidade ribossômica marcada. Portanto, a incorporação do GFP como uma tag epítopoa ao RPL18 de forma muito elegante permite a verificação do padrão de expressão desejado e, consecutivamente, a retração da fração polisome do mesmo tecido. Abordagens mais invasivas para assegurar padrões de promotores adequados são seguidas…

Materials

Sterilization
bleach, 13%	Sigma	71696
beaker	VWR	214-1172/74/75
desiccator with porcelaine plate (DURAN)	Sigma/Merck	Z317454-1EA/Z317594-1EA
EtOH, p.a.	Honeywell	02860-1L
HCl, 37%	Roth	4625.1
Tween 20	Sigma	P9416
Plate growth + harvesting
MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer	Duchefa	M0254
agar plant for cell culture	Applichem/Panreac	A2111.1000
DMSO	Sigma	D4540
forcepts	Rubis Switzerland	5-SA model
KOH	Fluka	60370
micropore/surgical tape	3M	1530-0
NAA	Duchefa	N0903
petri dishes 120×120 mm	Greiner bio-one	688102
scalpel	VWR/Swann-Morton	233-5454
tissues, neutral, two-layered			any supplier of your choice
Immunoprecipitation
GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA	Chromotek	e.g. gtma-100
Brij-35	Sigma	P1254-500G
centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)	Beckman Coulter	357001
Chloramphenicol	Applichem	C0378-25G
cotton gloves	VWR	113-7355
Cycloheximide, HPLC grade	Sigma	01810-1G
DEPC	VWR	E174	might have long delivery times
DTT	Fluka	43815
EGTA	Sigma	3054.3
homogenizers DUALL 23	KONTES GLASS CO (via VWR)	SCERSP885450-0023 (set)	SCERSP885451-0023 pestle only – SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times
Igepal CA-360	Sigma	I3021-100ml
KCl	Sigma	60130
MgCl2 hexahydrat	Roth	2189.2
mortar and pestle	VWR	470148-960 & 470019-978
PMSF	Roche	10 837 091 001
Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE	Sigma	P2393-500G
RNase-free water	Roth	T143.3
RNAZap	Thermo Fisher	AM9780/AM9782	for cleaning surfaces
Tris, >99.3%	Roth	AE15.3
Triton X-100	Fluka	T8787-250ml
Tween 20	Sigma	P9416-100ml
RNA extraction
2-Propanol, p.a.	Sigma	33539-1L-GL-R
Chloroform, HPLC grade	Scharlau	CL02181000
EtOH, p.a.	Honeywell	02860-1L
low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml	Eppendorf/Sigma	Z666548-250EA	LoBind
RNase-free DNase set	Qiagen	79254
RNeasy MiniElute Cleanup Kit	Qiagen	74204
TRIzol reagent	ThermoFisher/Ambion	15596018
Library preparation
15/50 mL Tube Magnetic Separator	Abraxis	PN 472250
AMPure beads	Beckman Coulter	A63881
Index Kit A	Illumina	FC-131-2001
Index Kit D	Illumina	FC-131-2004
neodymium magnets	Amazon/other	6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)
Nextera XT kit	Illumina	FC-131-1024/1096	https://emea.support.illumina.com/
PCR strips	ThermoScientific	AB-0266
SMARTer v4 kit	Takara Bioscience	634892	https://www.takarabio.com/
Bioanalyzer	Agilent	2100 Bioanalyzer Instrument	specialized equipment for RNA/DNA quality control
Tapestation	Agilent	4200 Tapestation Instrument	specialized equipment for RNA/DNA quality control
Fragment Analyzer	Agilent	5400 Fragment Analyzer System	specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
LabChip	PerkinElmer	LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer	specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
Qubit 4 Fluorometer	ThermoFisher	Q33239	specialized equipment for RNA/DNA concentration determination
qRT-PCR
GATA23	Microsynth		fwd: AGTGAGAATGAA AGAAGAGAAGGG; rev: GTGGCTGCGAAT AATATGAATACC
GH3.3	Microsynth		fwd: CAAACCAATCCT CCAAATGAC; rev: ACTTATCCGCAA CCCGACT
LBD29	Microsynth		fwd: TCTCCAACAACA GGTTGTGAAT; rev: AAGGAGCCTTAG TAGTGTCTCCA
UBC21	Microsynth		fwd: TGCGACTCAGGG AATCTTCT; rev: TCATCCTTTCTT AGGCATAGCG
SsoAdvanced Universal SYBR Green	Bio-Rad	#172-5270
iScript Adv cDNA Kit	Bio-Rad	#172-5038
miscellaneous
Falcon tubes 15 ml, Cellstar	Greiner bio-one	188261
Falcon tubes 50 ml, Cellstar	Greiner bio-one	210261
filter tips 1 ml	Axygen	TF-1000-R-S
filter tips 10 µl	Axygen	TF-10-R-S
filter tips 100 µl	Axygen	TF-100-R-S
filter tips 20 µl	Axygen	TF-20-R-S
filter tips 200 µl	Axygen	TF-200-R-S
microcentrifuge tubes 1.5 ml	SARSTEDT	72.690.001
Propidium iodide	Sigma	P4170-100MG
sequencing company	Novogene		en.novogene.com