Met behulp van meerlaagse Hydrogel Bioink in driedimensionale bioprinting voor homogene celdistributie
Summary
Hier ontwikkelden we een nieuwe meerlaagse gemodificeerde strategie voor vloeibare bioinks (gelatine methacryloyl met lage viscositeit) om de sedimentatie van ingekapselde cellen te voorkomen.
Abstract
Tijdens het op extrusie gebaseerde driedimensionale bioprintingproces kunnen vloeibare bioinks met een lage viscositeit cellen beschermen tegen membraanschade veroorzaakt door schuifstress en de overleving van de ingekapselde cellen verbeteren. Snelle celsedmentatie op basis van zwaartekracht in het reservoir kan echter leiden tot een inhomogene celverdeling in bioprintstructuren en dus de toepassing van vloeibare bioinks belemmeren. Hier ontwikkelden we een nieuwe meerlaagse gemodificeerde strategie voor vloeibare bioinks (bijvoorbeeld gelatine methacryloyl met lage viscositeit) om sedimentatie van ingekapselde cellen te voorkomen. Meerdere vloeibare interfaces werden gemanipuleerd in de meerlaagse bioink om interfaciale retentie te bieden. Bijgevolg werd de celsedmentatieactie die over aangrenzende lagen in het meerlaagse systeem ging, vertraagd in het bioinkreservoir. Er werd vastgesteld dat de interfaciale retentie veel hoger was dan de sedimentale aantrekkingskracht van cellen, wat een cruciale rol aantoont van de interfaciale retentie bij het voorkomen van celsedimentatie en het bevorderen van een meer homogene dispersie van cellen in het meerlaagse bioink.
Introduction
Driedimensionale (3D) bioprinting is een veelbelovende methode voor de vervaardiging van complexe architectonische en functionele replica’s van inheemse weefsels in biofabricage en regeneratieve geneeskunde1,2,3. De gemeenschappelijke strategieën van bioprinting, met inbegrip van inkjet, extrusie, en stereolithografie afdrukken, hebben voors en tegens vanuit verschillende perspectieven4. Onder deze technieken wordt de extrusieprocedure het meest gebruikt vanwege de kosteneffectiviteit. Bioink speelt een sleutelrol in de processtabiliteit van extrusie bioprinting. De ideale cel-beladen bioink moet niet alleen biocompatibel zijn, maar ook geschikt zijn voor mechanische eigenschappen5. Bioinks met een lage viscositeit worden meestal gepresenteerd als een vloeibare toestand. Deze bioinks kunnen gemakkelijk en snel worden afgezet en voorkomen dat celmembraan schade veroorzaakt door hoge schuifspanning tijdens extrusie. In complexe gevallen die lange termijn afdrukperioden vereisen, leidt een lage viscositeit echter vaak tot de onvermijdelijke sedimentatie van de ingekapselde cellen in het bioinkreservoir, wat meestal wordt aangedreven door de zwaartekracht en leidt tot een inhomogene celdispersie in het bioink6,7. Bijgevolg belemmert een bioink met inhomogene celdisperding de in vitro bioprinting van een functionele weefselconstructie.
Verschillende recente studies gericht op bioinks hebben gemeld de bevordering van homogene dispersiteit van ingekapselde cellen. Een gemodificeerde alginaat bioink op basis van dual-stage crosslinking werd gebruikt voor extrusie bioprinting8. Een alginaat polymeer werd gewijzigd met peptiden en eiwitten in deze studie. Cellen presenteerden een meer homogene verdeling in deze gemodificeerde alginaat dan in de veelgebruikte alginaat als gevolg van de gehechtheid sites die door de peptiden en de eiwitten. Als alternatief zijn gemengde bioinks gebruikt om de sedimentatie van cellen in bioink op te lossen. Een blended bioink met polyethyleenglycol (PEG) en gelatine of gelatine methacryloyl (GelMA) met verbeterde mechanische robuustheid werd gebruikt in een andere studie9. De ingekapselde cellen vertoonden een homogene verdeling, vooral omdat de viscositeit van het gemengde bioink werd verbeterd. In het algemeen zijn er verschillende factoren die van invloed zijn op de verspreiding van de ingekapselde cellen in het bioink, zoals de viscositeit van het bioink, de zwaartekracht van de cellen, de dichtheid van de cellen en de duur van de werkperiode. Onder deze factoren speelt de zwaartekracht van cellen een cruciale rol bij het bevorderen van sedimentatie. Het drijfvermogen en de wrijving die door de viskeuze bioink zijn onderzocht als de belangrijkste krachten tegen de zwaartekracht tot op heden10.
Hierin ontwikkelden we een nieuwe strategie om homogene dispersie van de ingekapselde cellen in bioink te bevorderen door meerdere vloeibare interfaces in het bioinkreservoir te manipuleren. Deze vloeibare interfaces die door de meerlaagse modificatie van bioink worden gecreëerd, kunnen niet alleen interfaciale retentie bieden, wat de sedimentatie van cellen vertraagt, maar ook een geschikt biocompatibiliteits- en rheologisch gedrag van het bioink behoudt. In de praktijk hebben we waterige GelMA-oplossing (5%, w/v) met zijdefibroine (SF) op een meerlaagse manier aangepast om in de lengterichting vier interfaces te produceren, waardoor interfaciale spanningen in het gemengde bioink worden ondersteund. Als gevolg hiervan werd de zwaartekrachtbelasting op de cellen gecompenseerd door de door de mens gemaakte interfaciale spanning, en een bijna homogene dispersie van de ingekapselde cellen in de bioink werd verkregen als gevolg van minder sedimentatie over de aangrenzende lagen cellen. Geen soortgelijk protocol om de sedimentatie van ingekapselde cellen te vertragen door het manipuleren van interfaciale retentie in vloeibare bioinks is gemeld tot op heden. We presenteren ons protocol hier om een nieuwe manier aan te tonen om celsedmentatie in bioprinting op te lossen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De stabiliteit van het meerlaagse systeem is een belangrijk punt om dit protocol succesvol uit te voeren. We hebben theoretisch de verspreiding van SF-moleculen in de GelMA-oplossing berekend op basis van Naumans studie13. Men vond dat de verspreiding van proteïnen in oplossing met hun moleculair gewicht verwant was. Het gemiddelde molecuulgewicht (MW) van runderserum albumine (BSA) is 66,5 kDa en de diffusiecoëfficiënt is 64-72 μm2/s. De gemiddelde MW van fibrinogen is 339,7 kDa, e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 en 81570422), National Key R&D Program of China (2018YFC1005002), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17JC1400200), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (Grant No. 2017SHZDZX01) en Shanghai Municipal Education Commission (Innovation Program 2017-01-07-00-07-E00027).
Materials
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510 (2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
