Utilizzo di Bioinchiostro idrogel multistrato nella biostampa tridimensionale per la distribuzione omogenea delle cellule
Summary
Qui, abbiamo sviluppato una nuova strategia modificata multistrato per bioinks a forma di liquido (gelatina methacryloyl con bassa viscosità) per prevenire la sedimentazione di cellule incapsulate.
Abstract
Durante il processo di biostampa tridimensionale basato sull’estrusione, bioink simili a liquidi con bassa viscosità possono proteggere le cellule dai danni alla membrana indotti dallo stress da taglio e migliorare la sopravvivenza delle cellule incapsulate. Tuttavia, la rapida sedimentazione cellulare guidata dalla gravità nel serbatoio potrebbe portare a una distribuzione cellulare inomogenea in strutture biostampate e quindi ostacolare l’applicazione di bioinchi a forma di liquido. Qui, abbiamo sviluppato una nuova strategia modificata multistrato per bioinks simili a liquidi (ad esempio, la gelatina methacryloyl con bassa viscosità) per prevenire la sedimentazione di cellule incapsulate. Più interfacce liquide sono state manipolate nel bioink multistrato per fornire ritenzione interfacciale. Di conseguenza, l’azione di sedimentazione cellulare che attraversa strati adiacenti nel sistema multistrato è stata ritardata nel serbatoio del bioink. Si è scoperto che la ritenzione interfacciale era molto superiore all’attrazione sedimentale delle cellule, dimostrando un ruolo critico della ritenzione interfacciale nella prevenzione della sedimentazione cellulare e nel promuovere una dispersione più omogenea delle cellule nel bioink multistrato.
Introduction
La biostampa tridimensionale (3D) è stato un metodo promettente per produrre complesse repliche architettoniche e funzionali dei tessuti nativi nella biofabbricazione e nella medicina rigenerativa1,2,3. Le strategie comuni di biostampa, tra cui la stampa a getto d’inchiostro, estrusione e stereolitografia, hanno pro e contro da diverse prospettive4. Tra queste tecniche, la procedura di estrusione è più comunemente utilizzata a causa della sua efficacia in termini di costi. Bioink svolge un ruolo chiave nella stabilità del processo di biostampa dell’estrusione. Il bioink carico di cellule ideale non deve essere solo biocompatibile, ma anche adatto per le proprietà meccaniche5. I bioink con bassa viscosità sono tipicamente presentati come uno stato liquido. Questi bioinks possono essere facilmente e rapidamente depositati ed evitare danni alla membrana cellulare indotti da un alto stress da taglio durante l’estrusione. Tuttavia, in casi complessi che richiedono periodi di stampa a lungo termine, la bassa viscosità spesso dà origine all’inevitabile sedimentazione delle cellule incapsulate nel serbatoio di bioinchiostro, che di solito è guidato dalla gravità e porta ad una dispersione cellulare inomogenea nel bioink6,7. Di conseguenza, un bioink con dispersione cellulare inomogenea ostacola la biostampa in vitro di un costrutto di tessuto funzionale.
Diversi studi recenti incentrati sui bioinks hanno segnalato la promozione della dispersione omogenea delle cellule incapsulate. Un bioinchiostro algerato modificato basato sul crosslinking a due stadi è stato utilizzato per la biostampa dell’estrusione8. Un polimero algerato è stato modificato con peptidi e proteine in questo studio. Le cellule presentavano una distribuzione più omogenea in questo alginato modificato rispetto all’alginato comunemente usato a causa dei siti di fissaggio forniti dai peptidi e dalle proteine. In alternativa, i bioink miscelati sono stati utilizzati per risolvere la sedimentazione delle cellule nel bioink. Un bioinchiostro miscelato contenente glicole di polietilene (PEG) e methacryloyl gelatina o gelatina (GelMA) con una maggiore robustezza meccanica è stato utilizzato in un altro studio9. Le cellule incapsulate presentavano una distribuzione omogenea principalmente perché la viscosità del bioinchiostro miscelato era migliorata. In generale, ci sono diversi fattori che influenzano la dispersione delle cellule incapsulate nel bioink, come la viscosità del bioink, la gravità delle cellule, la densità delle cellule e la durata del periodo di lavoro. Tra questi fattori, la gravità delle cellule svolge un ruolo fondamentale nel promuovere la sedimentazione. La galleggiabilità e l’attrito forniti dal bioink viscoso sono stati studiati come le principali forze contro la gravità fino ad oggi10.
In questo contesto, abbiamo sviluppato una nuova strategia per promuovere la dispersione omogenea delle cellule incapsulate nel bioink manipolando più interfacce liquide nel serbatoio di bioink. Queste interfacce liquide create dalla modifica multistrato del bioink possono non solo fornire ritenzione interfacciale, che ritarda la sedimentazione delle cellule, ma mantiene anche una compatibilità adeguata e il comportamento reologico del bioink. In pratica, abbiamo modificato la soluzione GelMA acquosa (5%, w/v) con fibroina di seta (SF) in modo multistrato per produrre longitudinalmente quattro interfacce, fornendo tensioni interfacciali nel bioink miscelato. Di conseguenza, il carico di gravità sulle cellule è stato compensato dalla tensione interfacciale artificiale, e una dispersione quasi omogenea delle cellule incapsulate nel bioink è stata ottenuta a causa di una minore sedimentazione attraverso gli strati adiacenti di cellule. Finora non è stato riportato alcun protocollo simile per rallentare la sedimentazione delle cellule incapsulate manipolando la ritenzione interfacciale nei bioinks liquidi. Vi presentiamo il nostro protocollo qui per dimostrare un nuovo modo di risolvere la sedimentazione cellulare in biostampa.
Protocol
Representative Results
Discussion
La stabilità del sistema a più livelli è un punto chiave per eseguire correttamente questo protocollo. Abbiamo teoricamente calcolato la diffusione delle molecole SF nella soluzione GelMA sulla base dello studio di Nauman13. Si è scoperto che la diffusione delle proteine in soluzione era correlata al loro peso molecolare. Il peso molecolare medio (MW) dell’albumina del siero bovino (BSA) è di 66,5 kDa, e il suo coefficiente di diffusione è 64-72 m2/s. L’MW medio di fibrinogeno è …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 e 81570422), National Key R&D Program of China (2018YFC1005002), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17JC1400200), Shanghai City Science and Technology Project (17JC1400200), Shanghai City Project (Major Grant. (Programma di innovazione 2017-01-07-00-07-E00027).
Materials
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510 (2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
