गुणात्मक और मात्रात्मक हिस्टोलॉजिकल तरीकों का उपयोग कर माउस भ्रूण में जन्मजात हृदय दोषों का विश्लेषण
Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम जन्मजात हृदय दोषों से जुड़े चूहों में विकासात्मक फेनोटाइप का गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण करने की प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं।
Abstract
जन्मजात हृदय दोष (सीएचडी) मनुष्यों में जन्म दोष का सबसे आम प्रकार है, जो सभी जीवित जन्मों का 1% तक प्रभावित करता है। हालांकि, CHD के लिए अंतर्निहित कारणों को अभी भी खराब समझा जाता है । विकासशील माउस CHD के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल का गठन करता है, क्योंकि चूहों और मनुष्यों के बीच हृदय विकासात्मक कार्यक्रम अत्यधिक संरक्षित हैं। प्रोटोकॉल विस्तार से वर्णन करता है कि वांछित गर्भावधि चरण के माउस भ्रूण का उत्पादन कैसे करें, डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए दिल को अलग करने और संरक्षित करने के तरीके, हिस्टोलॉजी द्वारा सामान्य प्रकार के सीएचडी की पहचान करने के लिए मात्रात्मक तरीके (उदाहरण के लिए, वेंट्रिकुलर सेप्टल आम मांसपेशियों के कॉम्पैक्टेशन फेनोटाइप को मापने के लिए दोष, एट्रियल सेप्टल दोष, पेटेंट डक्टस आर्टेरियोसस), और मात्रात्मक हिस्टोमॉहोमी विधियां। ये तरीके नमूना तैयारी, संग्रह और विश्लेषण में शामिल सभी चरणों को स्पष्ट करते हैं, जिससे वैज्ञानिकों को सही ढंग से और पुन: उत्पादन करने की अनुमति मिलती है।
Introduction
सीएचडी मनुष्यों में जन्म दोष का सबसे आम प्रकार है और जन्म दोष से संबंधित मृत्यु का प्रमुख कारण1,2,3,4,5,6हैं । हालांकि नवजात बच्चों के बारे में ९०% CHD जीवित रहते हैं, यह अक्सर महत्वपूर्ण रुग्णता और पिछले कुछ वर्षों में चिकित्सा हस्तक्षेप के साथ जुड़ा हुआ है, रोगियों के जीवन और स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली7,8,9,10पर भारी बोझ थोप । विशुद्ध रूप से आनुवंशिक कारकों के बाहर, CHD के कारणों को खराब4समझा जाता है । अमेरिकन हार्टएसोसिएशन और अन्य स्रोतों2,3,4,11के अनुसार सभी सीएचडी मामलों के ~ 56-66% के लिए अज्ञात कारण खाते । प्रसिद्ध कारकों में आनुवंशिक उत्परिवर्तन, सीएनवी, डी नोवो एकल न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट और एन्यूप्लाइडी शामिल हैं। यह संदेह है कि पर्यावरण और आहार कारक भी सीएचडी में योगदान देने वाले महत्वपूर्ण स्रोत हैं, जैसा कि मातृ जीवन शैली2,12,आर्थिक अभाव और रेस13को जोड़ने वाले महामारी विज्ञान के अध्ययनों द्वारा सुझाव दिया गया है, और फोलिक एसिड11,14 और बायोएक्टिव लिपिड रेटिनोइक एसिड15,16जैसे आहार कारकों में अनुसंधान द्वारा । सीएचडी और अन्य हृदय दोषों के तंत्र ों और कारणों की जांच करना निवारक रणनीतियों और उपन्यास चिकित्सीय विकल्प1,4,17,18,19विकसित करना महत्वपूर्ण है ।
विकासशील माउस स्तनधारियों में CHD का अध्ययन करने के लिए एक आधारशिला मॉडल है। हालांकि, नियोजित कुछ तरीकों और विश्लेषणों, जैसे हृदय आकृति विज्ञान के संरक्षण, विकासात्मक चरणों का विश्लेषण, और सीसीडी से जुड़े दोषों की पहचान, वैज्ञानिकों के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकती है जो मूत्र दिलों के विश्लेषण के लिए नए हैं। इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों का लक्ष्य इन प्रक्रियाओं के लिए गुणात्मक और मात्रात्मक दिशानिर्देश प्रदान करना है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में हम समझाते हैं कि वांछित गर्भावधि चरण के भ्रूण का उत्पादन करने के लिए समय पर संभोग कैसे करें, गर्भवती महिलाओं को बरकरार दिल की वसूली के लिए विच्छेदन करें (बहिर्वाह पथ जैसे संबद्ध ऊतकों सहित), हृदय निर्धारण और तैयारी के लिए क्रायोस्टेट सेक्शनिंग, बुनियादी हिस्टोलॉजी विधियां, आम हृदय दोषों का मात्रात्मक विश्लेषण, और हृदय की मांसपेशियों के कॉम्पैक्टेशन का गुणात्मक विश्लेषण, कुछ प्रकार के सीएचडी के लिए एक आम अग्रदूत फेनोटाइप।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल भ्रूणीय हृदयों में हृदय विकास के विश्लेषण में शामिल तकनीकों की पड़ताल करता है। इस विधि की कुछ सीमाएं प्रारंभिक तकनीकों के लिए आवश्यक शारीरिक निपुणता हैं, जिसके लिए अभ्यास की आवश्यकता हो ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aguirre लैब राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े, और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के रक्त संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या K01HL135464 के तहत और पुरस्कार संख्या 19IPLOI34660342 के तहत अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन द्वारा समर्थित है ।
Materials
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J – stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat – Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) – p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
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