تحليل عيوب القلب الخلقية في أجنة الفئران باستخدام أساليب النسيج النوعي والكمي
Summary
في هذا البروتوكول، نصف إجراءات التحليل النوعي والكمي للأنماط الظاهرية التنموية لدى الفئران المرتبطة بعيوب القلب الخلقية.
Abstract
عيوب القلب الخلقية (CHD) هي النوع الأكثر شيوعًا من العيوب الخلقية في البشر ، مما يؤثر على ما يصل إلى 1٪ من جميع المواليد الأحياء. ومع ذلك، لا تزال الأسباب الكامنة وراء CHD غير مفهومة بشكل جيد. الفأر النامية يشكل نموذجا قيما لدراسة CHD، وذلك لأن برامج النمو القلبي بين الفئران والبشر يتم الحفاظ عليها بدرجة عالية. يصف البروتوكول بالتفصيل كيفية إنتاج أجنة الفئران من مرحلة الحمل المطلوبة ، وأساليب لعزل والحفاظ على القلب للمعالجة النهائية ، والأساليب الكمية لتحديد الأنواع الشائعة من CHD حسب الأنسجة (على سبيل المثال ، الحاجز البطيني العيوب، وعيوب الحاجز الأذيني، وبراءة اختراع القناة الشريانية)، وطرق قياس الهيمتولوجيا الكمية لقياس الأنماط الظاهرية الشائعة للضغط العضلي. توضح هذه الأساليب جميع الخطوات التي ينطوي عليها إعداد العينات وجمعها وتحليلها ، مما يسمح للعلماء بقياس CHD بشكل صحيح ومستنسخ.
Introduction
CHDs هي النوع الأكثر شيوعا من العيوب الخلقية في البشر وهي السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالعيوب الخلقية1،2،3،4، 5،6. على الرغم من أن حوالي 90٪ من الأطفال حديثي الولادة البقاء على قيد الحياة CHD، فإنه يرتبط في كثير من الأحيان مع المراضة كبيرة والتدخلات الطبية على مر السنين، وفرض عبء ثقيل على حياة المرضى ونظام الرعاية الصحية7،8،9،10. خارج العوامل الوراثية البحتة ، وأسباب CHD غير مفهومة بشكل جيد4. أسباب مجهولة تمثل ~ 56-66٪ من جميع الحالات CHD وفقا لجمعية القلب الأمريكية وغيرها من المصادر2،3،4،11. وتشمل العوامل المعروفة الطفرات الوراثية، CNVs، دي نوفو المتغيرات النيوكليوتيدات واحد، وaneuploidy. ويشتبه في أن العوامل البيئية والغذائية هي أيضا مصادر هامة تساهم في CHD، كما اقترحت الدراسات الوبائية التي تربط بين نمط الحياةالأمومي2،12،الحرمان الاقتصادي، والعرق13،وعن طريق البحث في العوامل الغذائية مثل حمض الفوليك11،14 وحمض الريتينويك الدهون النشطة بيولوجيا15،16. التحقيق في آليات وأسباب CHD وغيرها من عيوب القلب والأوعية الدموية من المهم وضع استراتيجيات وقائية وخيارات علاجية جديدة1،4،17،18،19.
الفأر النامية هو نموذج حجر الزاوية لدراسة CHD في الثدييات. ومع ذلك، فإن بعض الأساليب والتحليلات المستخدمة، مثل تشريح الحفاظ على مورفولوجيا القلب، وتحليل مراحل النمو، وتحديد العيوب المرتبطة بـ CHD، يمكن أن تكون شاقة للعلماء الجدد في تحليل قلوب المورين. والهدف من الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول هو تقديم مبادئ توجيهية نوعية وكمية لهذه العمليات. وهكذا ، في هذا البروتوكول نشرح كيفية إجراء التزاوج في الوقت المناسب لإنتاج أجنة من مرحلة الحمل المطلوبة ، وتشريح الإناث الحوامل لاستعادة القلب سليمة (بما في ذلك الأنسجة المرتبطة بها مثل القناة الخارج) ، وتثبيت القلب والاستعداد ل أقسام ة الكبوتورستات، وطرق الأنسجة الأساسية، والتحليلات الكمية لعيوب القلب الشائعة، والتحليل النوعي لضغط عضلة القلب، وهو النمط الظاهري السلائف الشائعة لبعض أنواع CHD.
Protocol
Representative Results
Discussion
يستكشف هذا البروتوكول التقنيات التي ينطوي عليها تحليل تطور القلب في القلوب الجنينية. بعض القيود المفروضة على هذه الطريقة هي البراعة البدنية المطلوبة للتقنيات التحضيرية ، والتي قد تتطلب الممارسة ، والمهارة مع التصوير المجهر. إذا كانت الشرائح التي تم الحصول عليها في cryostat فوضوية ، فإن تلطي?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم مختبر أغيري من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة K01HL135464 وجمعية القلب الأمريكية تحت رقم الجائزة 19IPLOI34660342.
Materials
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J – stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat – Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) – p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
- Kathiresan, S., Srivastava, D. Genetics of human cardiovascular disease. Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).
- Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: The glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Pelech, A. N., Broeckel, U. Toward the etiologies of congenital heart diseases. Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).
- Zaidi, S., Brueckner, M. Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease. Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).
- Kenny, L. A., et al. Transplantation in the single ventricle population. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).
- Navaratnam, D., et al. Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation. The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).
- De Leval, M. R., Deanfield, J. E. Four decades of Fontan palliation. Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).
- Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).
- Jenkins, K. J., et al. Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge – A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young. Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).
- Botto, L. D., et al. Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study. Archives of Disease in Childhood – Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).
- Knowles, R. L., et al. Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects. Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).
- Feng, Y., et al. Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies. Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Liu, Y., et al. Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).
- Kurian, L., et al. Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development. Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).
- Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond. Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).
- Srivastava, D. Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis. Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- . Stage Definition Available from: https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998)
- Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017)
- . Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007)
- MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness. IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).
- Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy. Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).
- Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).
