Analyse af medfødte hjertefejl i museembryoner ved hjælp af kvalitative og kvantitative histologiske metoder
Summary
I denne protokol beskriver vi procedurer til kvalitativt og kvantitativt at analysere udviklingsfænotyper hos mus forbundet med medfødte hjertefejl.
Abstract
Medfødte hjertefejl (CHD) er den mest almindelige form for fødselsdefekt hos mennesker, der påvirker op til 1% af alle levendefødte. De underliggende årsager til CHD er dog stadig dårligt forstået. Den udviklende mus er en værdifuld model for studiet af CHD, fordi hjerteudviklingsprogrammer mellem mus og mennesker er stærkt bevaret. Protokollen beskriver i detaljer, hvordan man producerer museembryoner af den ønskede svangerskabsfase, metoder til at isolere og bevare hjertet til downstream-behandling, kvantitative metoder til at identificere almindelige typer chd ved histologi (f.eks. ventrikulær septal defekter, atrieflimren septal defekter, patent ductus arteriosus), og kvantitative histomorphometri metoder til at måle fælles muskulære komprimere fænotyper. Disse metoder formulerer alle de trin, der er involveret i forberedelse, indsamling og analyse af prøver, så forskerne kan måle CHD korrekt og reproducerbart.
Introduction
CHD’er er den mest almindelige form for fødselsdefekt hos mennesker og er den hyppigste årsag til dødsfald som følge af fødselsdefekter1,2,3,4,5,6. Selv om omkring 90% af nyfødte børn overlever CHD, er det ofte forbundet med betydelig sygelighed og medicinske indgreb i årenes løb, pålægge en tung byrde for patienternes liv og sundhedssystemet7,8,9,10. Uden for rent genetiske faktorer, årsagerne til CHD er dårligt forstået4. Uidentificerede årsager tegner sig for ~ 56-66 % af alle CHD-tilfælde ifølge American Heart Association og andre kilder2,3,4,11. Velkendte faktorer omfatter genetiske mutationer, CNVs, de novo enkelt nukleotid varianter, og aneuploidi. Der er mistanke om, at miljø- og kostfaktorer også er vigtige kilder, der bidrager til CHD, som foreslået af epidemiologiske undersøgelser, der forbinder mødres livsstil2,12, økonomisk afsavn og race13og ved forskning i kosten faktorer såsom folinsyre11,14 og den bioaktive lipid retinsyre15,16. Det er vigtigt at undersøge mekanismerne og årsagerne til CHD og andre kardiovaskulære defekter for at udvikle forebyggende strategier og nye terapeutiske løsningsmodeller1,4,17,18,19.
Den udviklende mus er en hjørnesten model for at studere CHD i pattedyr. Men nogle af de anvendte metoder og analyser, såsom dissektioner bevare hjertemorfologi, analyse af udviklingsmæssige faser, og identifikation af CHD-relaterede defekter, kan være skræmmende for forskere, der er nye til analyse af murine hjerter. Målet med de metoder, der er beskrevet i denne protokol, er at tilbyde kvalitative og kvantitative retningslinjer for disse processer. Således forklarer vi i denne protokol, hvordan man udfører tidsvist parring er at producere embryoner af den ønskede svangerskabsuge fase, dissekere drægtige kvinder til intakt hjerte opsving (herunder tilhørende væv såsom udstrømning tarmkanalen), hjerte fiksering og forberedelse til kryot skæring, grundlæggende histologi metoder, kvantitative analyser af fælles hjertefejl, og kvalitativ analyse af hjertemusklen komprimering, en fælles forløber fænotype til nogle typer af CHD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol udforsker de teknikker, der er involveret i analysen af hjerteudvikling i embryonale hjerter. Nogle begrænsninger af denne metode er den nødvendige fysiske fingerfærdighed for de forberedende teknikker, som kan kræve praksis, og dygtighed med mikroskop billeddannelse. Hvis skiverne opnået på kryoat er rodet, vil hæmatoxylin og eosin farvning ikke være klar, eller hvis billederne taget på mikroskopet har dårlig belysning, så den metode, der anvendes med ImageJ vil ikke arbejde. En begrænsning af…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den Aguirre Lab er støttet af National Heart, Lung, og Blood Institute of National Institutes of Health under tildeling nummer K01HL135464 og af American Heart Association under tildeling nummer 19IPLOI34660342.
Materials
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J – stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat – Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) – p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
- Kathiresan, S., Srivastava, D. Genetics of human cardiovascular disease. Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).
- Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: The glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Pelech, A. N., Broeckel, U. Toward the etiologies of congenital heart diseases. Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).
- Zaidi, S., Brueckner, M. Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease. Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).
- Kenny, L. A., et al. Transplantation in the single ventricle population. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).
- Navaratnam, D., et al. Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation. The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).
- De Leval, M. R., Deanfield, J. E. Four decades of Fontan palliation. Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).
- Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).
- Jenkins, K. J., et al. Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge – A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young. Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).
- Botto, L. D., et al. Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study. Archives of Disease in Childhood – Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).
- Knowles, R. L., et al. Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects. Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).
- Feng, Y., et al. Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies. Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Liu, Y., et al. Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).
- Kurian, L., et al. Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development. Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).
- Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond. Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).
- Srivastava, D. Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis. Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- . Stage Definition Available from: https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998)
- Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017)
- . Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007)
- MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness. IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).
- Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy. Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).
- Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).
